Слесарев В.И. - Химия. Основы химии живого. 2000 (учебник для вузов)

ный участки кривой титрования не информативны, поскольку в эти моменты в системе происходит не только нейтрализация аминокислоты, но и гидролиз ее солей, где она выступает в ки­ слой среде катионом, а в щелочной среде - анионом.

Аминокислоты кислотные содержат в заместителе дополни­ тельную кислотную группу: аспарагиновая и глутаминовая кислоты - карбоксильную группу (СООН), цистеин - тиольную

слотные свойства этих групп характеризуются величиной pKJKH) (табл. 21.1). Все эти кислоты в водных растворах по мере умень­ шения кислотности среды, т. е. возрастания pH, могут находиться в четырех формах: катиона, молекулы, моноаниона и дианиона (разд. 8.2), причем строение моноаниона зависит от того, какая из двух кислотных групп в молекуле ионизуется первой.

В молекулах аспарагиновой и глутаминовой кислот, а также в цистеине вначале ионизуется кислотная группа заместителя, так как pKJRH) < pKJNH.s), поэтому строение их моноаниона "слож­ ное", поскольку он содержит две отрицательно заряженные группы - СОСГ и К ' - и одну аммонийную группу, заряженную положительно. Для этих аминокислот изоэлектрическая точка вычисляется по формуле: р / = г/2 [pKJCOOH) + plfa(RH)].

Аспарагиновая и глутаминовая кислоты в биологических средах (pH « 7) на 100 % , а цистеин - около 1 % находятся в виде мо­ ноаниона. Для аниона цистеина в растворе возможно таутомерное равновесие "сложный" моноанион "простой” моноанион.

Моноанион тирозина имеет строение "простого" таутомера, так как pKa(NHd) < pKa(RH), и его изоэлектрическая точка вычис­ ляется по обычной формуле:

РI = У2 [Р^(СООН) + р В Д ) ]

536

Аминокислоты основные содержат в заместителе основные группы (см. табл. 21.1). Поэтому лизин, аргинин и гистидин в водных растворах по мере уменьшения кислотности среды могут находиться в четырех формах: дикатиона, монокатиона, молекулы и аниона. Структура монокатиона основных аминокислот слож­ ная, так как она содержит две положительно заряженные группы

(NH3 и RH) и одну отрицательно заряженную группу (СОСГ). Струк­ тура молекул этих кислот (а именно: какая основная группа несет положительный заряд) зависит от того, какая из двух протонированных основных групп в монокатионе ионизуется первой.

Нзйснсоон pg“(COOH>

|+

R+H

дикатион

Увеличение pH среды

Вслучае молекул лизина и аргинина в растворе наиболее ус­ тойчив таутомер ТБИ II, а для гистидина характерно таутомер­ ное равновесие с преобладанием ТБИ I. Изоэлектрическая точка основных аминокислот вычисляется по формуле:

p / = V 2 [ р К а ( Ш 3 ) + Р К а ( Ш 1 ) ]

В биологических средах (pH = 7) основные аминокислоты на­ ходятся в виде монокатиона, причем лизин и аргинин на 100 % , а гистидин - около 1 % . Эти кислоты являются активными акцепто­ рами не только протонов, но и других комплексообразователей (ка­ тионов d-металлов), выступая полидентатными лигандами.

Знание кислотно-основных свойств аминокислот имеет ис­ ключительно важное значение для их разделения, идентифи­ кации и количественного анализа, так как позволяет осуществ­ лять эти процессы с определенной формой данной аминокислоты (молекулой, катионом или анионом). Если в анализируемой системе имеется смесь указанных частиц, то это сильно затруд­ няет анализ аминокислот и снижает точность любого метода. Понимание особенностей кислотно-основных свойств аминокис­ лот крайне необходимо для объяснения многих свойств пепти­ дов и белков.

537

21.2.2. КОМПЛЕКСООБРАЗУЮЩИЕ СВОЙСТВА

Все аминокислоты, отдавая протон, образуют как полидентатные лиганды хелатные комплексы с катионами d-металлов (разд. 10.2). При этом донорами электронных пар выступают и аминогруппа, и ионизованная карбоксильная группа аминокис­ лот. Например, все а-аминокислоты со свежеприготовленным Си(ОН)2 образуют растворимый электронейтральный хелатный комплекс, окрашенный в ярко-синий цвет:

комплекс ярко-синего цвета

Эту реакцию можно использовать в качестве неспецифиче­ ского метода обнаружения а-аминокислот.

Кислотные и основные а-аминокислоты, содержащие допол­ нительные протонодонорные или протоноакцепторные группы, являются более активными лигандами, чем аминокислоты ней­ тральные. С позиции комплексообразования с катионами био­ металлов (разд. 10.5, 13.2) и в соответствии с теорией жестких и мягких реагентов цистеин и гистидин проявляют особую ак­ тивность, так как они содержат легкополяризуемые ("мягкие") группы, соответственно тиольную и имидазольную, которые об­ разуют достаточно прочные связи с "мягкими" катионами био­ металлов. Высокая комплексообразующая способность этих ами­ нокислот за счет активных групп заместителя сохраняется в пеп­ тидах и белках, их содержащих.

Реакции комплексообразования аминокислот играют чрезвы­ чайно важную роль в поддержании металло-лигандного гомео­ стаза, а также в хелатотерапии (разд. 10.5). Знание комплексо­ образующих свойств аминокислот позволяет понять соответст­ вующие свойства пептидов и белков.

21.2.3. ЭЛЕКТРОФИЛЬНО-НУКЛЕОФИЛЬНЫЕ СВОЙСТВА

Двойственная природа аминокислот, обусловленная наличи­ ем в молекуле и карбоксильной, и аминогруппы, проявляется также в электрофильно-нуклеофильных взаимодействиях. За счет карбонилсодержащего фрагмента они могут выступать как элек­ трофилы, являясь донором ацильной группы, а за счет неподеленной электронной пары азотсодержащего фрагмента - как нуклео­ филы. Это наглядно проявляется в реакциях ацилирования.

Реакции аци ли рования . Аминокислоты в присутствии силь­ ных кислот при взаимодействии со спиртами легко образуют ам-

538

монийные соли сложных эфиров, из которых при действии ще­ лочи получают свободные эфиры:

H3N-CRH-COOH СНз0Н’ НС1» Н20 + [H3N—CRH—СООСН3]СГ Na0H>

гидрохлорид метилового эфира аминокислоты

—► H2N-CRH-COOCH3 + NaCl + Н20

метиловый эфир аминокислоты

Таким образом, в кислой среде, когда в аминокислотах ами-

+

ногруппа блокирована протоном (—NH3), аминокислоты высту­ пают ацилирующим реагентом, т. е. донором ацильной группы, ацилируя в приведенной реакции молекулу спирта.

В то же время в щелочной среде аминокислоты за счет сво­ бодной аминогруппы выступают акцептором ацильной группы от сильного ацилирующего реагента, например хлорангидрида карбоновой кислоты:

Приведенные реакции свидетельствуют, что в аминокисло­ тах ацилирование протекает и по карбоксильной, и по амино­ группе. Поэтому когда в лабораторных условиях необходимо, чтобы в аминокислотах реагировала только одна из этих групп, другая должна быть защищена, т. е. инактивирована.

Карбонилсодержащий фрагмент аминокислоты в сильноще­ лочной среде защищается за счет образования соли карбоновой кислоты, а в других случаях - путем превращения его в слож­ ноэфирную (—COOR') или в другую группировку, где электрофильность карбонильного атома углерода резко снижена из-за появления сильного электронодонора в группе.

Аминогруппа в аминокислотах защищается в сильнокислой среде за счет ее протонирования (НзЫ+), а в других случаях - пу­ тем ее ацилирования (R'CONH—), т. е. появления у аминогруппы электроноакцептора, уменьшающего нуклеофильность атома азо­ та. Таким образом, перечисленные способы защиты функцио­ нальных групп аминокислот заключаются в том, что снижается электрофильность карбонильного атома углерода в результате введения сильного электронодонора или снижается нуклеофиль­ ность атома азота аминогруппы за счет сильного электроноак­ цептора. Для удобства в формулах аминокислот, защищенных по карбоксильной или по аминогруппе, вместо формулы защитной группы будет использоваться соответственно знак #, символизи­ рующий нуклеофильность, или знак о - электрофильность:

539

Вводимые защитные группы должны отвечать следующим требованиям: легко и избирательно вводиться в молекулу; на­ дежно инактивировать защищаемую группу; легко удаляться из молекулы. Для удаления защитных групп в основном исполь­ зуется реакция гидролиза, но могут применяться и другие ре­ акции, например их восстановление.

Аминокислоты с защищенной аминогруппой легко вступают в реакции ацилирования, характерные для карбоновых кислот, например, образуют хлорангидриды или смешанные ангидриды аминокислот:

В образовавшихся производных аминокислот происходит активация электрофильности карбонильного атома углерода. Карбонильный фрагмент с повышенной электрофильностью для

краткости будем обозначать —С ^ ° . Эти соединения легко аци- X

лируют спирты или амины с образованием сложных эфиров или амидов аминокислот соответственно:

диметиламид аминокислоты

В организме аспарагиновая и глутаминовая кислоты под дей­ ствием соответствующих ферментов и АТФ легко ацилируют ам­ миак с образованием аспарагина и глутамина соответственно:

При ацилировании аминокислот со свободной аминогруппой аминокислотой с активированной карбонильной группой обра­ зуются дипептиды, в которых и амино-, и карбоксильная груп­ пы защищены. Эти защиты легко снимаются путем гидролиза:

540

н\

+II

—► H3N— CRH— С—NH—CR'H— COO"

Таким способом получают также три-, тетра- и полипептиды, в которых аминокислоты связаны между собой пептидной свя­ зью —СО—NH—, характерной и для белков. В организме пепти­ ды синтезируются прямо из аминокислот, но при участии соот­ ветствующих ферментов.

При отсутствии защитных групп молекулы а-аминокислот при нагревании вступают в реакцию взаимного ацилирования, отщепляя межмолекулярно две молекулы воды и образуя цик­ лическое соединение дикетопиперазин:

О

дикетопиперазин

Реакции алкилирования. Аминокислоты, защищенные по кар­ боксильной группе, легко вступают в реакции электрофильного за­ мещения, характерные для аминов, например ацилирования, кото­ рая рассмотрена выше, или алкилирования. Протеканию реакции алкилирования атома азота аминокислот способствует щелочная среда, так как в ней происходит связывание продуктов реакции:

—► (CH3)3N— CRH— СОСГ

бетаин аминокислоты

Образующееся в итоге соединение имеет фиксированную би- полярно-ионную структуру и называется бетаином аминокисло­ ты, а в случае глицина (R = Н) - просто бетаином. В бетаине

541

атом азота несет положительный заряд и является электрофиль­ ным центром. Поэтому бетаин может быть источником метильной группы для нуклеофильного центра другого соединения, т. е. метилирующим реагентом. В организме с помощью бетаи­ на протекает реакция трансметилирования, например алкили­ рование гомоцистеина с образованием метионина:

Высокая нуклеофильность атома азота а-аминокислот по­ зволяет проалкилировать его 2,4-динитрофторбензолом (ДНФБ, реактив Сэнджера). В этом соединении электрофильность бензоль­ ного ядра вследствие влияния двух сильных электроноакцептор­ ных нитрогрупп значительно повышена, что сильно увеличивает способность атома фтора вступать в реакцию замещения:

NO2

02N— \ 0 / — F + H2N— CRH СОСГ

ДНФБ

N02

—► 02N— (С л — HN— CRH— COO"

ДНФ-производное аминокислоты

Образующееся динитрофенильное производное аминокисло­ ты легко выделяется и идентифицируется хроматографически. Метод служит для определения аминокислотной последователь­ ности белка, т. е. его первичной структуры.

Реакция с формальдегидом. В слабощелочной среде (pH » 7), ко­ гда а-аминокислоты частично переходят в моноанион, содержащий свободную аминогруппу, они легко вступают в реакцию нуклео­ фильного присоединения к формальдегиду. При избытке формаль­ дегида образуется N, N'-диметилольное производное аминокислоты:

542

В таких производных аминокислот основность атома азота изза электроноакцепторных заместителей сильно понижена. Это позволяет использовать реакцию с формальдегидом для количе­ ственного определения а-аминокислот методом формольного титрования (метод Сёренсена), где в качестве титранта исполь­ зуется щелочь (индикатор фенолфталеин). Большая склонность аминогрупп в аминокислотах или белках реагировать с фор­ мальдегидом приводит к необратимой денатурации белков в его присутствии. Этим объясняются высокая токсичность формаль­ дегида и его стерилизирующая способность.

21.2.4.ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА

а-Аминокислоты вступают в разнообразные окислительно­ восстановительные реакции, сопровождаемые изменением степе­ ней окисления углеродных атомов и углеродного скелета моле­ кулы. Эти реакции происходят как внутримолекулярно, так и межмолекулярно. Однако среди всех природных а-аминокис- лот особенно чувствителен к действию окислителей цистеин, легко окисляемый за счет атома серы тиольной группы (—SH)

вцистин, содержащий дисульфидную группировку (—S—S—) (разд. 9.3.9, 12.2.6).

Тиол-дисульфидное равновесие. Цистеин, как все тиолы (разд. 17.2), выступая восстановителем, легко окисляется, обра­ зуя цистин, являющийся дисульфидом цистеина и сопряжен­ ным ему окислителем.

Цистеин и цистин составляют сопряженную восстанови­ тельно-окислительную пару (вопреки правилам, исторически на первое место поставлена восстановленная форма), для которой характерно тиол-дисульфидное равновесие. Значение нормаль­ ного восстановительного потенциала этой пары (cpQ = -0 ,22 В) свидетельствует, что восстановительные свойства у нее преобла­ дают над окислительными. Поэтому цистеин является эффектив­ ным антиоксидантом, выполняя защитные функции при воздей­ ствии на организм сильных окислителей благодаря восстанови­ тельным свойствам тиольной группы (разд. 9.3.9, 12.2.6).

В то же время цистеин был первым препаратом, проявившим противолучевое действие, который уменьшал степень лучевого поражения и повышал выживаемость больных. При радиацион­ ном воздействии в водных средах организма возникают сильные окислители ЮН, *Н02, Н2О2, Ю2, называемые активными или

543

токсичными формами кислорода (разд. 9.3.9, 12.2.5). Наряду с окислителями при этом воздействии в организме возникают другие токсиканты - короткоживущие сильные восстановите­ ли: гидратированный электрон (егИДР) и атомарный водород Н*. Компоненты сопряженной восстановительно-окислительной па­ ры цистеин - цистин активно взаимодействуют и с теми и дру­ гими агрессивно-токсичными частицами, нейтрализуя их. Имен­ но этим объясняется эффективность цистеина при остром луче­ вом поражении. Легкое и быстрое за счет цистеинредуктазы взаимодействие тиольных групп двух молекул цистеина с обра­ зованием дисульфидной связи цистина и обратимость этой ре­ акции играют важную роль в регуляции процессов обмена в организме. Превращение цистеина в цистин приводит к образо­ ванию дисульфидной связи в пептидах и белках, влияя на их конформацию (разд. 21.3 и 21.4).

При исчерпывающем окислении тиольной группы цистеина последний переходит в цистеиновую кислоту, содержащую сульфогруппу. Появление в молекуле еще одной сильной кислотной и электроноакцепторной группы способствует протеканию реакции декарбоксилирования с образованием таурина:

Таурин, взаимодействуя с холевой кислотой, образует таурохолевую кислоту, принимающую активное участие в эмуль­ гировании и всасывании жиров (разд. 20.3).

Разнообразные окислительно-восстановительные реакции а- аминокислот с участием углеродных атомов протекают как в организмах, так и вне их. В организме направление и скорость этих реакций определяются ферментом и коферментом, участ­ вующих в них.

Декарбоксилирование. В а-аминокислотах электроноакцептор-

+

ная группа ~NH3 расположена в a-положении к группе —СОО~, также проявляющей электроноакцепторные свойства. Это сильно поляризует связь Са-Сх, повышая электрофильность и нуклеофильность ее углеродных атомов и способствуя внутримолеку­ лярной окислительно-восстановительной дисмутации между ними вплоть до расщепления указанной связи с образованием СО2, т. е. декарбоксилированием. В лабораторных условиях эта реакция протекает при нагревании а-аминокислот в присутст­ вии Ва(ОН)2:

[ок^ль]

544