Казимирский А.Н. - Биоокисление

стратного фосфорилирования также относится катализируемое сукцинил- КоА-синтетазой (сукцинилтиокиназой) образование ГТФ в цикле Кребса:

В мышцах в процессе мышечного сокращения активно протекает еще одна реакция субстратного фосфорилирования, катализируемая креатинфосфаткиназой.

Эта реакция обратима и в условиях покоя идет образование креатинфосфата из АТФ и креатина, а в процессе мышечной работы накопленный креатинфосфат отдает фосфорильную группу на АДФ с образованием АТФ, необходимого для процессов мышечного сокращения.

Реакции субстратного фосфорилирования являются важным источником получения АТФ, особенно в анаэробных условиях. Для эукариотов главным источником АТФ является окислительное фофорилирование, использующее энергию электронов, освобождающихся при дегидрировании субстратов, при восстановлении кислорода, через реализацию трансмембранного протонного градиента потенциала.

Дегидрирование субстратов и восстановление кислорода (образование воды) как основной источник энергии для синтеза АТФ

АТФ – чрезвычайно важная молекула клетки. Она непрерывно синтезируется и используется. Энергия для синтеза АТФ поступает от субстратов, отдающих электроны в ходе их дегидрирования. Электроны извлекаются из субстратов в ходе гликолиза и гликогенолиза (в цитозоле), при окислении жирных кислот и в общих путях метаболизма: при преобразовании пирувата в ацетил-КоА и в цикле трикарбоновых кислот (в митохондриальном матриксе). Молекулы НАДН и ФАДН2 переносят эти электроны в дыхательную цепь, локализованную во внутренней митохондриальной мембране. Энергия этих электронов используется для создания трансмембранного протонного градиента потенциала, используемого для синтеза АТФ.

11

4

Рис.3 Реакции пируватдегидрогеназного

комплекса

1. Реакция декарбоксилирования пирувата.

Значение декарбоксилирования пирувата для извлечения энергии из молекулы исключительно велико. Три углеродных атома пирувата имеют разную степень окисления. Углерод метильной группы (-СН3) имеет степень окисления –3 и, следовательно, в дальнейшем при его окислении до СО2 (С+4) можно получить 7 электронов. Углерод кето-группы (›С=О) окислен значительно (степень окисления +2) при его окислении до СО2 можно извлечь 2 электрона. А углерод карбоксильной группы окислен почти полностью (+3). Поэтому карбоксильная группа это до некоторой степени балластная часть молекулы с позиции извлечения энергии, окисление этого углерода может дать лишь 1 электрон. Удаление карбоксильной группы (т.е. реакцию декарбоксилирования) катализирует фермент пируватдегидрогеназа в активном

13

центре которого локализован тиаминдифосфат – кофермент декарбоксилирования.

1.В активном центре фермента происходит прямое взаимодействие двух атомов углерода с образованием между ними ковалентной связи. Это взаимодействие обусловлено разноименностью зарядов, которыми обладают углерод кето-группы пирувата с одной стороны и атом углерода тиазольного кольца тиаминпирофосфата с другой.

2.На этой стадии Е1 (пируватдегидрогеназа) переносит атом водорода

идвухуглеродный ацетильный фрагмент (СН3-СО-) на молекулу липоевой кислоты, локализованную в активном центре фермента Е2 (дигидролипоамидацетилтрансферазы). При этом в активном центре фермента образуется ацетилтиоэфир липоамида, а восстановление при этом липоамида способствует извлечению еще 1 электрона (от 2-го углеродного атома пирувата.

Рис.4 Схема реакции декарбоксилирования пирувата

3.В этой реакции СоА-SH атакует тиоэфирную связь в активном центре

фермента Е2, разрывает еѐ и присоединяет к себе двухуглеродный ацетильный фрагмент (СН3-СО-). Происходит образование ацетил~СоА, который покидает активный центр фермента Е2 (дигидролипоамидацетилтрансферазы). При этом оба атома серы липоевой кислоты полностью восстановлены.

4.В этой реакции фермент Е3 (дигидролипоамиддегидрогеназа) катализирует перенос двух атомов водорода с восстановленного липоамида, нахо-

дящегося в активном центре фермента Е2 на кофермент ФАД, локализованный в своѐм активном центре. При этом в активном центре фермента Е3 образуется ФАДН2.

5.В активный центр дегидрогеназы (Е3) пируватдегидрогеназного комплекса входит НАД+ и присоединяет к себе 2 электрона и протон от кофермента ФАДН2 и в форме НАДН переносит их в процесс окислительного фос-

14

форилирования.

Связь окислительного декарбоксилирования пирувата с процессом окислительного фосфорилирования

При превращении пирувата в ацетил-СоА происходит образование НАДН, транспортирующего электроны в дыхательную цепь. Пара электронов в процессе окислительного фосфорилирования может участвовать в синтезе АТФ с образованием до 2,5 моль АТФ на 2 моль электронов. Усиление распада АТФ в клетке ведет к повышению концентрации АДФ и ускорению окисления НАДН в дыхательной цепи. Повышение концентрации НАД+, в свою очередь, стимулирует окислительное декарбоксилирование пирувата. Напротив, повышение концентрации АТФ и НАДН снижает скорость этого процесса.

Таким образом, изменения отношений АДФ/АТФ и НАДН/НАД+ - важнейшие внутриклеточные регуляторные сигналы, отражающие энергетические потребности клетки и регулирующие скорость окислительного декарбоксилирования пирувата. Каталитическая активность пируватдегидрогеназного комплекса снижается, когда в клетках имеется достаточно ―топлива‖ в виде жирных кислот и ацетил~СоА.

Регуляция пируватдегидрогеназного комплекса (ПДК)

Регуляция пируватдегидрогеназного комплекса (ПДК) имеет важное значение для обеспечения цикла трикарбоновых кислот ―топливными‖ молекулами ацетил-СоА. Точная регуляция этого комплекса имеет важное значение в связи с невозможностью обратного преобразования ацетил-СоА в пируват, т.к. ферменты, необходимые для этого в организме человека отсутствуют.

Активность ПДК регулируется различными способами: доступностью субстратов, ингибированием продуктами реакции, аллостерическим путѐм, путѐм ковалентной модификации (табл. 2).

Активность пируватдегидрогеназного комплекса увеличивается при повышении концентрации АДФ, внутриклеточного кальция, под влиянием гормонов: инсулина и адреналина.

При повышении концентрации АДФ ПДК находится в нефосфорилированной активной форме. Этот эффект усиливается при повышении концентрации внутриклеточного кальция, который активирует фосфатазу ПДК. Такой механизм активации ПДК особенно важен в мышцах и жировой ткани. Активация ПДК происходит также под влиянием инсулина. Один из эффектов инсулина – повышение концентрации внутримитохондриального кальция, это приводит к активированию ПДК. В клетках миокарда ПДК активируется адреналином.

15

Табл. 2 Регуляция активности пируватдегидрогеназного комплекса

заключительный этап катаболизма, локализованный в матриксе митохондрий. В нем 4-х углеродное соединение оксалоацетат конденсируется с 2-х углеродным ацетильным компонентом, который вносит в процесс молекула ацетил-СоА, с образованием 6-ти углеродной трикарбоновой кислоты (цитрата). Далее цитрат подвергается изомеризации и окислению с последующим декарбоксилированием (не путать с окислительным декарбоксилированием) образовавшегося оксалосукцината.

Образующееся при этом 5-ти углеродное соединение α-оксоглутарат (α-кетоглутарат) при окислительном декарбоксилировании превращается в 4- х углеродное соединение сукцинат. Дальнейшие превращения сукцината приводят к регенерированию оксалоацетата. Поэтому одна молекула оксалоацетата может многократно использоваться для окисления ацетильных остатков. Два атома углерода включаются в цикл в виде ацетильного компонента и 2 атома углерода покидают цикл в виде двух молекул СО2.

Таким образом, двухуглеродный фрагмент молекулы ацетил-СоА подвергается полному окислению. 8 электронов, ранее принадлежащих молекуле ацетил~СоА, покидают цикл в связанной форме: в виде трех молекул НАДН

16

и одной ФАДН2. Затем они переносятся в процесс окислительного фосфорилирования, где энергия каждой пары электронов переносимых НАДН, преобразуется в энергию макроэргических связей – до 2,5 моль АТФ на 2 моль электронов. А энергия пары электронов переносимых ФАДH2, ведет к образованию до 1,5 моль АТФ на 2 моль электронов. Всего в процессе окислительного фосфорилирования при окислении этих переносчиков электронов образуется до 9 молекул АТФ. Одна макроэргическая связь генерируется в самом цикле в форме молекулы ГТФ (равноценной АТФ). Итого, теоретически до 10 моль АТФ может быть генеририровано при окислении 1 моль двухуглеродного фрагмента ацетил~КоА в цикле трикарбоновых кислот сопряженном с процессом окислительного фосфорилирования.

Рис. 5 Схема цикла трикарбоновых кислот. В цикл входят молекулы ацетил~СоА, а покидают 8 электронов на своих мобильных переносчиках в составе НАДН и ФАДН2.

Реакции цикла трикарбоновых кислот

1.Реакция образования цитрата (лимонной кислоты). Эта реакция представляет собой альдольную конденсацию с последующим гидролизом, которую катализирует цитрат-синтаза. При расщеплении тиоэфирной связи освобождается коэнзим А и выделяется значительная тепловая энергия. Равновесие в реакции сильно сдвинуто вправо.

2.Превращение цитрата в изоцитрат. Изомеризация цитрата осуществляется путем дегидратации с последующей гидратацией. В результате происходит взаимоперемещение Н и ОН. Фермент назван аконитазой, поскольку промежуточное соединение цис-аконитат не покидает активный центр фермента.

17

3. Реакция окисления изоцитрата катализируется изоцитратдегидрогеназой, сопровождается декарбоксилированием образующегося оксалосукцината и ведет к образованию α-оксоглутарата (α-кетоглутарата). НАД+ в реакции играет роль второго субстрата захватывая пару электронов и в форме НАДН вовлекает их в процесс окислительного фосфорилирования. Самая медленная реакция цикла. Аллостерически активируется АДФ.

ФЕРМЕНТ – ИЗОЦИТРАТ-ДЕГИДРОГЕНАЗА

4. РЕАКЦИЯРис.6ОКИСЛИТЕЛЬНОГО. Начальные реакции циклаДЕКАРБОКСИЛИРОВАНИЯтрикарбоновых кислот

18

реакцию переноса своей фосфатной группы на АДФ с образованием АТФ, который расходуется в клеточных процессах.

ГТФ + АДФ ↔ ГДФ + АТФ

Эту реакцию катализирует нуклеозидфосфаткиназа.

На этом заканчивается первая стадия цикла трикарбоновых кислот.

ВТОРАЯ СТАДИЯ ЦИКЛА ТРИКАРБОНОВЫХ КИСЛОТ: (РЕГЕНЕРИРОВАНИЕ ОКСАЛОАЦЕТАТА)

Рис. 8 Реакции второй стадии цикла трикарбоновых кислот

6.Фермент сукцинат-дегидрогеназа, действующий в 6-й реакции – флавопротеин, содержащий ковалентно присоединенный ФАД в своем активном центре. В отличие от других ферментов цикла трикарбоновых кислот сукци- нат-дегидрогеназа прочно закреплена во внутренней митохондриальной мембране. Фермент состоит из двух субъединиц, одна из которых содержит ФАД. В состав двух субъединиц включены железо-серные центры. В одной

субъединице в форме - Fe2S2, а в другой в форме – Fe4S4. Оба железо-серных центра сопряжены с компонентами дыхательной цепи и участвуют в транспорте электронов.

7.Реакцию гидратации катализирует фермент фумарат-гидратаза (фумараза), локализованный в матриксе митохондрий. Особенностью реакции является абсолютная субстратная специфичность этого фермента. Фермент катализирует гидратацию только транс-формы фумарата.

8.Заключительную реакцию цикла трикарбоновых кислот катализирует НАД-зависимая малат-дегидрогеназа, локализованная в митохондриальном матриксе. Особенность реакции состоит в том, что в ней равновесие сильно сдвинуто влево.

Поскольку оксалоацетат, синтезируемый в этой реакции постоянно расходуется на образование цитрата (цитрат-синтазная реакция), то в интактных

20