Рис. 7.108. Два механизма инициации трансляции. а) Для нормального кэп-зависимого механизма инициациитрансляциитребуетсянаборфакторовинициации,сборкакоторыхнамРНКстимулируется наличием структуры 5'-кэпа и поли-A хвоста (см. также рис. 6.72). б) Для IRES-зависимого механизма, преимущественнонаблюдаемогоувирусов,требуетсятолькоподгруппафакторовнормальнойинициациитрансляции,которыенапрямуюсобираются на свернувшейся в определеннуюструктурупоследо-
связывающим комплексом. Это приводит к прекращению большей части трансляции в хозяйской клетки и эффективно привлекает аппарат трансляции на последовательности IRES, которые содержатся во многих вирусных мРНК. Укороченный eIF4G еще способен инициировать трансляцию на этих внутренних участках и даже может стимулировать трансляцию определенных вирусных мРНК, содержащих IRES. Избирательная активация IRES-зависимой трансляции также может происходить и на мРНК клетки хозяина. Например, когда клетки млекопитающих вступают на путь запрограммированной клеточной смерти (описано в главе 18), фактор eIF4G расщепляется и происходит общее снижение скорости трансляции. Однако некоторые белки, крайне важные для контроля процесса клеточной смерти, оказывается, транслируются с мРНК, содержащих последовательности IRES, что позволяет осуществлять их непрерывный синтез. Таким образом, механизм IRES позволяет транслировать избранные мРНК с высокой скоростью, несмотря на общее снижение способности клетки инициировать синтез белка.
7.5.14. Экспрессия генов может регулироваться изменением стабильности мРНК
Большая часть мРНК в клетках бактерий весьма нестабильна и имеет время полужизни меньше пары минут. За быстрое разрушение таких мРНК обычно от-
Глава 7. Контроль генной экспрессии 759
ветственны экзонуклеазы, расщепляющие их в направлении 3′ →5′. Поскольку как синтез, так и разрушение бактериальных мРНК происходит стремительно, бактерия может быстро адаптироваться к изменениям окружающей среды.
Как правило, в эукариотических клетках мРНК более стабильна. Некоторые мРНК, например, как мРНК, кодирующая β-глобин, имеют время полужизни более 10 часов, но у большинства оно значительно короче и обычно составляет меньше 30 минут. Особенно коротким временем полужизни обладают мРНК, кодирующие, например, факторы роста или регуляторные белки, скорость синтеза которых в клетках должна меняться быстро.
Существует два основных механизма разрушения эукариотических мРНК. Оба начинаются с постепенного укорочения экзонуклеазой поли-A хвоста — этот процесс начинается сразу же, как мРНК достигает цитоплазмы. В широком смысле, такое укорочение поли-A работает в качестве таймера, отсчитывающего время жизни каждой мРНК. После уменьшения длины поли-A хвоста до критической величины (около 25 нуклеотидов у человека) два пути расходятся. По одному из них 5′-кэп удаляется (процесс называется дэкэпированием), и «неприкрытая» мРНК быстро деградируется, начиная со своего 5′-конца. По другому пути разрушение мРНК продолжается с 3′-конца через поли-A хвост внутрь кодирующей последовательности (рис. 7.109). Большинство эукариотических мРНК деградируют при помощи обоих механизмов.
Рис.7.109.ДвамеханизмадеградацииэукариотическоймРНК.Придостижениикритическогопорога длиныполи-AхвостаиндуцируетсядеградациямРНКвнаправлении3'→5',котораяможетзапускатьсяпотерейбелков,связывающихсясполи-Aхвостом(см.рис.6.40).Какпоказанонарис.7.110,деаденилазаассоциируетс3'-поли-Aхвостоми5'-кэпом,итакаяорганизацияможетдаватьсигналодекэпированиипослеукороченияполи-Aхвоста.Здесьпоказанадеградациявнаправлениях5'→3'и3'→5'наразных молекулахРНК,нодваэтихпроцессамогутпроисходитьодновременнонаоднойитойжемолекулеРНК. (АдаптированоизC. A. BeelmanandR. Parker,Cell81:179–183,1995.СразрешенияElsevier
Почти все мРНК подвержены этим двум типам разрушения, и специфические последовательности каждой мРНК определяют, как быстро будет наступать каждый этап и, следовательно, как долго каждая мРНК просуществует в клетке и с нее может образовываться белок. Последовательности 3′-UTR особенно важны для контроля времени жизни мРНК, и они часто содержат участки связывания для специфических белков, повышающих или понижающих скорость уменьшения длины поли-A хвоста, декэпирования или деградации в направлении 3′ → 5′. На время полужизни мРНК также влияет эффективность ее трансляции. Процессы
760 Часть 2. Основные генетические механизмы
укорачивания поли-A и декэпирования непосредственно конкурируют с аппаратом трансляции мРНК, следовательно, любые факторы, затрагивающие эффективность трансляции мРНК, будут склонны оказывать противоположный эффект на дегра-
дацию (рис. 7.110).
Рис. 7.110. Конкуренция между трансляцией и разрушением мРНК. Те же самые две особенности молекулы мРНК: ее 5'-кэп и 3'-поли-A хвост — используются как при инициации трансляции, так и при связанномсдеаденилированиемразрушениимРНК(см.рис.7.109).Деаденилаза,котораяукорачивает поли-Aхвоствнаправлении3' → 5',ассоциируетс5'-кэпом.Какописановглаве6(см.рис.6.72),аппаратинициациитрансляциитакжесвязываетсяс5'-кэпомиполи-Aхвостом.(АдаптированоизM.Gaoetal.,
Mol.Cell5:479–488,2000.СразрешенияElsevier.)
Время полужизни большей части мРНК эукариот контролируется уменьшением длины поли-A хвоста, но некоторые мРНК могут разрушаться посредством специализированного механизма, который совершенно пропускает этот этап. В таких случаях специфические нуклеазы разрезают мРНК изнутри, эффективно декэпируя один конец и удаляя полиадениловый хвост у другого, так что обе половинки быстро деградируют. Разрушаемые подобным способом мРНК несут специфические нуклеотидные последовательности, часто находящиеся в 3′-UTR, которые служат узнающими последовательностями для этих эндонуклеаз. Такая стратегия весьма упрощает плотную регуляцию стабильности таких мРНК путем блокировки сайта эндонуклеазы в ответ на внеклеточные сигналы. Например, добавление к клеткам железа уменьшает стабильность мРНК, которая кодирует рецепторный белок, связывающий железотранспортирующий белок трансферрин, что приводит к образованию меньшего количества рецептора. Этот эффект опосредуется чувствительным к железу РНК-связывающим белком аконитазой, который также контролирует трансляцию мРНК ферритина. Аконитаза может связываться с 3′-UTR мРНК трансферринового рецептора и, препятствуя расщеплению мРНК эндонуклеазами, увеличивать образование рецептора. При добавлении железа аконитаза отделяется от мРНК, раскрывая ее сайты расщепления и тем самым понижая стабильность мРНК (рис. 7.111).
Глава 7. Контроль генной экспрессии 761
Рис. 7.111. Два механизма посттрансляционной регуляции, опосредуемой концентрацией железа.
а)Принедостаткежелезасвязываниеаконитазыс5'-UTRмРНКферритинапрепятствуетинициациитранс- ляции,асвязываниеаконитазыс3'-UTRмРНКрецепторатрансферринаблокируетсайтырасщепления эндонуклеазойи,следовательно,стабилизируетмРНК.б)Вответнаувеличениеконцентрациижелеза в цитозоле клетка повышает уровень синтеза ферритина, чтобы связать избыток железа, и снижает уровень синтеза рецепторов трансферрина, чтобы импорт железа через плазматическую мембрану былменьше.Обаответаобусловленыоднимитемжечувствительнымкжелезурегуляторнымбелком аконитазой, который узнает общие черты в структуре «стебель-петля» в мРНК, кодирующие ферритин и рецептор трансферрина. Аконитаза отделяется от мРНК, когда связывается с железом. Но поскольку рецептор трансферрина и ферритин регулируются при помощи разных типов механизмов, их уровни реагируютнаизменениеконцентрациижелезапротивоположнымобразом,несмотрянаточтоврегуляциипринимаетучастиеодинитотжечувствительныйкжелезурегуляторныйбелок.(Адаптировано из M. W. Hentze et al., Science 238: 1570–1573, 1987, и J. L. Casey et al., Science 240: 924–928, 1988. С раз-
решенияAAAS.)
7.5.15. Полиаденилирование в цитоплазме может регулировать трансляцию
Первоначальное полиаденилирование молекулы РНК (описано в главе 6) происходит в ядре, очевидно, автоматически для практически всех предшественников эукариотических мРНК. Как только что было рассмотрено, поли-A хвосты у большинства мРНК в цитозоле постепенно укорачиваются, и в конце концов РНК деградируют. Однако в некоторых случаях поли-A хвосты специфических мРНК в цитозоле удлиняются, и этот механизм служит еще одной формой регуляции трансляции.
Созревающие ооциты и яйцеклетки представляют собой наиболее яркий пример. Многие из нормальных путей деградации мРНК, кажется, отключены в этих гигантских клетках, так что клетки могут создавать большие запасы мРНК при
762 Часть 2. Основные генетические механизмы
подготовке к оплодотворению. Многие мРНК запасаются в цитоплазме, имея только 10–30 адениновых остатков на 3′-конце, и в этой форме они не транслируются. В особые моменты времени в ходе созревания ооцита и сразу после оплодотворения — когда клетке требуются белки, кодируемые этими мРНК, — цитозольная поли-А-полимераза к отдельным мРНК присоединяет поли-A последовательность, что значительно стимулирует трансляцию этих мРНК.
7.5.16. Малые некодирующие РНК-транскрипты регулируют многие гены животных и растений
В предыдущей главе была представлена центральная догма биологии, согласно которой поток генетической информации идет от ДНК через РНК к белку (рис. 6.2). Но мы видели, что молекулы РНК выполняют много важных заданий в клетке, помимо того что служат промежуточными переносчиками генетической информации. Серия недавно сделанных поразительных открытий показала, что некодирующих РНК намного больше, чем считали раньше, и играют они прежде непредвиденные, но хорошо известные роли в регулировании экспрессии генов.
Особое значение у животных и растений имеет тип короткой некодирующей РНК, именуемый микроРНК (microRNA; miРНК). Например, у человека экспрессируется более 400 разных miРНК, и, по-видимому, они регулируют по крайней мере одну треть всех генов человека, кодирующих белки. После образования miРНК спариваются со специфическими мРНК и регулируют их стабильность и процесс их трансляции. Предшественники miРНК синтезируются РНК-полимеразой II
итакже проходят через кэпирование и полиаденилирование. Затем они подвергаются специальному типу процессинга, после которого происходит сборка miРНК с группой белков и образуется РНК-индуцируемый комплекс сайленсинга, или
RISC (RNA-induced silencing complex). После своего образования RISC ищет свои целевые мРНК, проводя поиск комплементарных нуклеотидных последовательностей (рис. 7.112). Этот поиск в значительной степени облегчается белком Argonaute, компонентом RISC, который выставляет 5′-область miРНК так, чтобы она была оптимально расположена для спаривания с другой молекулой РНК (рис. 7.113). У животных область спаривания типично составляет семь нуклеотидных пар
иобычно расположена в 3′-UTR целевой мРНК.
После того как miРНК связала мРНК, возможно несколько исходов. Если комплементарно спаренные основания занимают участок значительной протяженности, мРНК расщепляется белком Argonaute, эффективно удаляющим ее поли-A хвост, и облегчая ее доступность для действия экзонуклеаз (см. рис. 7.109). Вслед за расщеплением мРНК RISC (со связанной miРНК) высвобождается и может начинать поиск других мРНК. Соответственно, одна miРНК может действовать каталитически, разрушая множество комплементарных ей мРНК. Можно рассматривать miРНК как направляющие последовательности, которые сводят вместе разрушающие нуклеазы и специфические мРНК.
Если комплементарность между miРНК и мРНК не столь значительна, Argonaute не разрезает мРНК, скорее, подавляется трансляция мРНК и происходит ее дестабилизация. Этот эффект связан с уменьшением длины поли-A хвоста и перемещением мРНК к цитозольным структурам, называемым процессирующими тельцами (pro- cessing bodies; P-тельца), где мРНК изолируются от рибосом и в итоге декэпируются и деградируют. P-тельца представляют собой динамичные структуры, состоящие из больших комплексов мРНК и РНК-деградирующих ферментов. Полагают, что
Глава 7. Контроль генной экспрессии 763
Рис.7.112.ПроцессингимеханизмдействияmiРНК.ПредшественникmiРНК,благодарякомплементарностиоднойчастисвоейпоследовательностидругой,образуетдвухцепочечнуюструктуру.Онаобрезается ещевядре,азатемэкспортируетсявцитозоль,гдепроисходитеедальнейшеерасщеплениеферментом Dicer с образованием соответствующей miРНК. Белок Argonaute в сочетании с другими компонентами RISCпервоначальносоединяетсясобеимицепямиmiРНК,расщепляетиотбрасываетоднуизних.Другая цепь, используя механизм комплементарного спаривания оснований, направляет RISC к специфическим мРНК. Если совпадение между двумя РНК значительное, как это часто наблюдается у растений, Argonaute разрезает целевую мРНК, что приводит к ее быстрой деградации. У животных совпадение междуmiРНКимРНКчастонепревышаеткороткойобласти«затравки»размером7нуклеотидоввблизи 5'-конца miРНК. Такой небольшой уровень комплементарности между двумя последовательностями РНКприводиткингибированиютрансляции,дестабилизациимРНКиеепереносукP-тельцам,гдеона витогедеградирует.
это те места в клетке, где происходит последняя стадия разрушения большинства мРНК — даже тех, что не находятся под контролем miРНК (рис. 7.114).
Несколько свойств делают miРНК особенно ценными регуляторами экспрессии генов. Во-первых, одна miРНК может регулировать целый ряд различных мРНК при
ровано из N. H. Tolia and L. Joshua-Tor, Nat. Chem. Biol. 3: 36–43, 2007. С разрешения Macmillan PublishersLtd.)
условии, что мРНК содержат общую последовательность в их нетранслируемых областях. Такая ситуация вполне типична в случае человека, где некоторые miРНК контролируют сотни разных мРНК. Вовторых, регуляция при помощи miРНК может быть комбинаторной. Когда спариванию между miРНК и мРНК не удается запустить расщепление, дополнительные miРНК, связывающиеся с той же мРНК, приводят к дальнейшему падению скорости
ее трансляции. Как обсуждалось ранее в этой главе относительно регуляторных белков, комбинаторный контроль генов значительно расширяет доступные клетке возможности, увязывая экспрессию генов не с одним регулятором, а с комбинацией различных регуляторов. В-третьих, miРНК занимают сравнительно мало места в геноме по сравнению с белком. Действительно, их малый размер является одной из причин, почему miРНК были открыты только недавно. Мы только начинаем осознавать влияние miРНК, но уже ясно, что они представляют собой очень важную часть аппарата клетки для регуляции экспрессии ее генов.
7.5.17. РНК-интерференция служит защитным механизмом клетки
Многие из белков, принимающих участие в только что описанных регуляторных механизмах, связанных с miРНК, также выполняют вторую функцию, действуя
Рис. 7.114. Визуализация P-телец.Клетки человека окрасили антителами к компоненту фермента декэпирования мРНК Dcp1a (изображения слева) и к белку Argonaute (изображения посередине). При наложениидвухизображений(изображениясправа)видно,чтодвабелкасолокализованы(или,говорят, колокализуются)вблизицентров,называемыхP-тельцами.(АдаптированоизJ. Liuetal.,Nat.CellBiol.7:
643–644,2005.СразрешенияMacmillanPublishersLtd.)
Глава 7. Контроль генной экспрессии 765
как защитный механизм: они организуют деградацию чужеродных молекул РНК, особенно тех, которые встречаются в двухцепочечной форме. Этот механизм, име-
нуемый РНК-интерференцией (RNA interference; RNAi), обнаружен у самых разнообразных организмов, включая одноклеточные грибы, растения и червей, что предполагает его эволюционную античность. Многие мобильные элементы и вирусы в ходе своих жизненных циклов образуют двухцепочечную РНК, хотя бы на короткое время, и РНК-интерференция помогает держать этих потенциально опасных «захватчиков» под контролем. Как будет видно, РНК-интерференция также снабдила ученых мощной экспериментальной технологией, позволяющей выключать экспрессию индивидуальных генов.
Наличие двухцепочечной РНК в клетке запускает РНК-интерференцию путем привлечения белкового комплекса, содержащего Dicer — ту же самую нуклеазу, которая осуществляет процессинг miРНК (см. рис. 7.112). Этот белковый комплекс расщепляет двухцепочечную РНК на короткие (примерно 23 нуклеотидные пары)
фрагменты, называемые малыми интерферирующими РНК (small interfering RNAs; siРНК). Белок Argonaute и другие компоненты RISC связывают затем в такие двухцепочечные siРНК, как и в случае с miРНК, и одна цепь дуплекса РНК разрезается белком Argonaute и отбрасывается. Оставшаяся одноцепочечная молекула siРНК направляет RISC обратно к комплементарным молекулам РНК, образуемым вирусом или мобильным элементом, и, так как нуклеотидные последовательности siРНК и РНК-мишени полностью комплементарны, Argonaute разрезает эти молекулы, приводя к их быстрой деградации (рис. 7.115).
Каждый раз, когда RISC расщепляет новую молекулу РНК, он высвобождается — таким образом, как мы видели в случае с miРНК, единичная молекула РНК может действовать каталитически, разрушая много комплементарных РНК. Некоторые организмы используют дополнительный механизм, который многократно усиливает сигнал РНК-интерференции. В таких организмах РНК-зависимые РНК полимеразы могут превращать продукты siРНК-зависимого расщепления в еще большее количество двухцепочечных РНК. Такая амплификация гарантирует, что, начавшись, РНК-интерференция может продолжаться даже после того, как вся инициировавшая ее двухцепочечная РНК деградирована или рассеялась. Например, это позволяет делящимся клеткам продолжать осуществлять РНК-интерференцию, запущенную еще в родительских клетках.
У некоторых организмов активность РНК-интерференции может распространяться путем переноса фрагментов РНК от клетки к клетке. Это особенно важно для растений (чьи клетки связаны тонкими соединительными каналами, как описано в главе 19), поскольку это позволяет целому растению приобрести устойчивость к действию РНК-вируса после заражения только нескольких его клеток. В широком смысле ответ системы РНК-интерференции напоминает определенные механизмы иммунной системы животных: в обоих случаях вторгающийся организм вызывает специализированный ответ и — через амплификацию «атакующих» молекул — организм хозяина становится системно защищенным.
7.5.18. РНК-интерференция может управлять процессом образования гетерохроматина
Только что описанный механизм РНК-интерференции не обязательно останавливается на разрушении молекул РНК-мишеней. В некоторых случаях аппа-
рат РНК-интерференции может избирательно выключать синтез целевых РНК. Чтобы этот поразительный механизм заработал, короткие siРНК, получающиеся
врезультате действия белка Dicer, собираются с группой белков (включая белок
Argonaute) с образованием комплекса RITS (RNA-induced transcriptional silencing,
РНК-индуцируемого сайленсинга транскрипции). Используя одноцепочечную siРНК
вкачестве направляющей последовательности, этот комплекс связывает комплементарные РНК-транскрипты по мере их появления из транскрибирующей РНКполимеразы II (см. рис. 7.115). Расположившись на геноме подобным образом, комплекс RITS привлекает белки, которые ковалентно модифицируют соседние гистоны, и в конечном счете направляет образование и распространение гетерохроматина, предотвращая дальнейшую инициацию транскрипции. В некоторых случаях комплекс RITS также индуцирует метилирование ДНК, которое, как отмечалось, может подавлять экспрессию генов в еще большей степени. Поскольку гетерохроматин и метилирование ДНК могут распространяться самостоятельно, первоначальный сигнал, поданный с помощью РНК-интерференции, может продолжать подавлять экспрессию генов еще долго после того, как рассеялись все молекулы siРНК.
Глава 7. Контроль генной экспрессии 767
Образование гетерохроматина, направляемое РНК-интерференцией, является важным защитным механизмом клетки, который ограничивает накопление мобильных элементов в геноме благодаря поддержанию их в транскрипционно неактивной форме. Однако тот же самый механизм используется и во множестве нормальных процессов, происходящих в клетке. Например, у многих организмов аппарат РНК-интерференции поддерживает образование гетерохроматина около центромер. Центромерные последовательности ДНК транскрибируются в обоих направлениях, образуя комплементарные РНК-транскрипты, которые могут спариваться с образованием двухцепочечной РНК. Такая двухцепочечная РНК запускает РНК-интерференцию и стимулирует образование гетерохроматина у центромер. В свою очередь, такой гетерохроматин необходим центромерам для точного разделения хромосом в ходе митоза (см. рис. 4.50).
7.5.19. РНК-интерференция стала мощным инструментом экспериментаторов
Вероятно, изначально РНК-интерференция возникла как защитный механизм, но затем она стала совершенно неотъемлемой частью многих биологических процессов, происходящих в нормальной клетке: от контроля экспрессии генов и до структуры хромосом. Ученые также довели эту технологию до совершенства, превратив в мощный экспериментальный инструмент, который позволяет инактивировать практически любой ген, вызывая на него ответ системы РНК-интерференции. Такая техника, применяемая в культурах клеток и в некоторых случаях в организмах целых животных и растений, произвела революцию в генетических подходах клеточной и молекулярной биологии. Более подробно это будет обсуждаться в последующих главах (см. разд. 8.5.16). Потенциал РНК-интерференции для лечения болезней человека огромен. Поскольку у человека многие нарушения возникают в результате неправильной экспрессии генов, возможность выключать эти гены, вводя экспериментально полученные комплементарные молекулы siРНК, представляется высокоперспективным направлением медицины. Замечательно, что механизм РНК-интерференции открыт совсем недавно и мы все еще заворожены деталями его механики и спектром его биологической значимости.
Заключение
В клетках многие этапы пути, ведущего от РНК к белку, регулируют- ся, чтобы держать под контролем экспрессию генов. Наряду с регуляцией, на стадии инициации транскрипции большая часть генов контролируется на множестве уровней. Регуляторные механизмы включают: 1) аттенуацию РНК-транскрипта путем преждевременной терминации трансляции; 2) выбор альтернативного сайта сплайсинга РНК; 3) контроль формирования 3′-конца РНК посредством его расщепления и полиаденилирования; 4) редактирование РНК; 5) контроль экспорта из ядра в цитозоль; 6) локализацию мРНК в опреде- ленных местах клетки; 7) контроль инициации трансляции; 8) регулируемую
деградацию мРНК. Большинство этих процессов основано на узнавании специфи- ческих последовательностей или структур на молекуле РНК, что подлежит регулированию, и это делают либо регуляторные белки, либо регуляторные молекулы РНК. Особенно широко в посттранскрипционном контроле клетка использует РНК-интерференцию — когда направляющие РНК спариваются
