Volume1

738 Часть 2. Основные генетические механизмы

ческие реакции. Недавнее открытие рибопереключателей (riboswitches) показало, что РНК также может образовывать контролирующие устройства, регулирующие экспрессию генов. Рибопереключатели представляют собой короткие последовательности РНК, меняющие свою конформацию при связывании с небольшими молекулами, например молекулами метаболитов. Каждый рибопереключатель узнает специфическое низкомолекулярное соединение, и происходящее в результате конформационное изменение используется для регуляции экспрессии генов. Рибопереключатели часто располагаются около 5′-конца молекул мРНК и сворачиваются в то время, пока синтезируется мРНК, и в зависимости от того, связана регуляторная малая молекула или нет, блокируют движение РНК-полимеразы или позволяют ей двигаться вперед (рис. 7.93).

Рибопереключатели особенно часто встречаются у бактерий, где они чувствительны к наличию в клетке важных низкомолекулярных метаболитов и в соответствии с этим регулируют экспрессию генов. Возможно, к их наиболее примечательным свойствам относится высокая специфичность и сродство, с которыми каждый рибопереключатель узнает только соответствующую ему малую молекулу; во многих случаях все химические характеристики малой молекулы считываются РНК (рис. 7.93, в). Кроме того, наблюдаемые значения аффинности связывания достигают тех же значений, которые характеризуют сильное связывание между низкомолекулярными соединениями и белками.

Рис. 7.93. Рибопереключатель, реагирующий на гуанин. а) В этом примере, взятом из бактериальной клетки, рибопереключатель контролирует экспрессию генов биосинтеза пуринов. При низкой концентрации гуанина в клетках элонгирующая

РНК-полимераза транскрибирует гены биосинтеза пуринов,следовательно,происходитэкспрессияферментов, необходимых для синтеза гуанина. б) При избыточной концентрации гуанина он связывается с рибопереключателем, вызывая его конформационное изменение, что заставляет РНК-полимеразу терминироватьтранскрипцию(см.рис.6.11).в)Гуанин (красный), связанный с рибопереключателем.

Показаны только те нуклеотиды, которые образуют гуанин-связывающий карман. Существует много другихрибопереключателей,включаяте,которыераспознаютS-аденозилметионин,коэнзимB12,фла- винмононуклеотид,аденин,лизиниглицин.(АдаптированоизM. MandalandR. R. Breaker,Nat.Rev.Mol. CellBiol.5:451–63,2004,сразрешенияMacmillanPublishersLtd.,иC. K. VanderpoolandS. Gottesman,Mol. Microbiol.54:1076–1089,2004,сразрешенияBlackwellPublishing.)

Глава 7. Контроль генной экспрессии 739

Рибопереключатели, возможно, дают нам пример самых экономичных контролирующих гены устройств, поскольку совершенно пренебрегают необходимостью использовать регуляторные белки. В примере, показанном на рис. 7.93, рибопереключатель контролирует элонгацию транскрипции, но рибопереключатели регулируют и другие этапы экспрессии генов, что будет видно дальше по ходу этой главы. Очевидно, что крайне сложные устройства контроля генов могут быть построены из коротких последовательностей РНК.

7.5.3.  Альтернативный сплайсинг РНК позволяет получать различные формы белка от одного гена

Как обсуждалось в главе 6, сплайсинг РНК укорачивает транскрипты многих эукариотических генов, удаляя последовательности интронов из пре-мРНК. Мы также видели, что в клетке сплайсинг РНК-транскрипта может происходить по-разному, и, таким образом, с одного гена получаются различные полипептидные цепи – про-

цесс, называемый альтернативным сплайсингом РНК (alternative RNA splicing; см.

рис. 6.27 и рис. 7.94). Существенная часть генов животных (примерно 40 % у мухи и 75 % у человека) образует многочисленные белки подобным образом.

Если существует несколько возможных точек сплайсинга в транскрипте, то из одного гена можно получить десятки различных белков. В одном предельном случае ген дрозофилы с помощью альтернативного сплайсинга может образовать до 38 000 различных белков с одного гена (рис. 7.95), но в экспериментах пока обнаружена только часть этих форм. Учитывая, что геном дрозофилы состоит приблизительно из 14 000 идентифицированных генов, ясно, что сложность белкового состава организма может значительно превышать число его генов. Этот пример также иллюстрирует опасность постановки знака равенства между числом генов и сложностью организации организма. Например, альтернативный сплайсинг является сравнительно редким явлением у одноклеточных почкующихся дрожжей, но весьма распространен у дрозофилы. У почкующихся дрожжей примерно 6 200 генов, только 300 из которых подвергаются сплайсингу, и практически все из них имеют лишь один интрон. Говорить, что у мухи только в 2–3 раза больше генов, чем у дрожжей, значит значительно преуменьшать разницу в сложности этих двух геномов.

Рис.7.94.Четыревариантаальтернативногосплайсинга РНК. В каждом случае один тип РНК-транскрипта сплайсируется двумя альтернативными способами с образованием двух разных мРНК (1 и 2). Синими прямоугольникамиотмеченыпоследовательностиэкзонов,которые сохраняютсявобеихмРНК.Голубыепрямоугольникисоответствуют возможным последовательностям экзонов, имеющимсялишьвмРНКодноготипа.Прямоугольники, соединенные красными линиями, отмечают места удаленияпоследовательностейинтронов(желтые).(Адап-

тировано с разрешения из A. Andreadis, M. E. Gallego and B. Nadal-Ginard,Annu.Rev.CellBiol.3:207–242,1987.Сраз- решенияAnnualReviews.)

Глава 7. Контроль генной экспрессии 741

в разных типах клеток различных вариантов белка в соответствии с потребностями клетки. Например, в разных тканях тропомиозин синтезируется в различных специализированных формах (см. рис. 6.27). Формы многих других клеточноспецифичных белков образуются таким же способом.

Сплайсинг РНК может регулироваться как негативно — когда регуляторная молекула перекрывает доступ аппарата, осуществляющего сплайсинг, к определенному сайту расщепления на РНК; так и позитивно — когда регуляторная молекула помогает направить аппарат сплайсинга к сайту, пропускаемому в других случаях

(рис. 7.96).

Рис.7.96.НегативнаяипозитивнаярегуляцияальтернативногосплайсингаРНК.а) Принегативнойре-

гуляциибелок-репрессорсвязываетсястранскриптомпре-мРНКиблокируетдоступаппаратасплайсинга к границе сплайсинга. Это часто приводит к использованию скрытых сайтов сплайсинга и, таким образом,кизменениювариантасплайсинга(непоказан).б)Припозитивнойрегуляцииаппаратсплайсинга не способен эффективно удалять определенную интронную последовательность без помощи белкаактиватора. Поскольку нуклеотидные последовательности, с которыми связываются эти активаторы, могутрасполагатьсянамногонуклеотидныхпардальшеконтролируемыхимиграницсплайсинга,они частоназываютсяэнхансерамисплайсинга.

Вследствие гибкости процесса сплайсинга РНК блокирование «сильного» сайта сплайсинга часто будет приводить к проявлению «слабого» сайта и в результате — к различным вариантам сплайсинга. Подобно этому при подавлении конкурирующего сайта активация субоптимального сайта сплайсинга может заканчиваться альтернативным сплайсингом. Таким образом, сплайсинг молекулы пре-мРНК можно рассматривать как хрупкий баланс между конкурирующими сайтами сплайсинга — баланс, который может легко смещаться в одну или другую сторону под действием регуляторных белков.

7.5.4.  Открытие альтернативного сплайсинга требует пересмотра понятия «ген»

С тех пор, как стало известно, что эукариотические гены обычно содержат интроны, а их кодирующие последовательности можно состыковать по-разному, вновь встал вопрос о том, что следует понимать под словом «ген». Первое определение гена на молекулярном уровне было предложено в начале 1940-х гг. на основании

742 Часть 2. Основные генетические механизмы

изучения биохимической генетики гриба нейроспора. До этого времени геном считали область генома, которая в ходе мейоза обособляется как отдельная единица и ответственна за проявление определенного фенотипического признака, например, белых или красных глаз у дрозофилы либо гладких или морщинистых семян у гороха. Работа на нейроспоре показала, что большинство генов соответствуют областям генома, направляющим синтез единственного фермента (для каждго гена — своего). На основании этого возникло предположение, что один ген кодирует одну полипептидную цепь. Эта гипотеза оказалась весьма плодотворной для последующих исследований. Когда в 1960-х гг. стало больше известно о механизмах экспрессии генов, ген стали определять как фрагмент ДНК, который транскрибируется с образованием РНК, кодирующей одну полипептидную цепь (или одну структурную РНК, как например, молекулы тРНК или рРНК). Открытие в конце 1970-х гг. прерывистых генов и интронов легко укладывалось в первоначальное определение гена при условии, что одна полипептидная цепь определяется РНК, транскрибируемой с любой одной последовательности ДНК. Однако теперь нам стало ясно, что в клетках высших эукариот благодаря альтернативному сплайсингу РНК многие последовательности ДНК могут кодировать набор различных, но родственных белков. Что же тогда следует считать геном?

В тех относительно редких случаях, когда два сильно различающихся эукариотических белка образуются из одной транскрипционной единицы, говорят, что эти белки кодируются различными генами, которые на хромосоме перекрываются. Однако определение большинства вариантов белка, образующихся в результате альтернативного сплайсинга РНК, как продуктов перекрывающихся генов, может показаться излишне сложным. Проще изменить исходную формулировку и считать геном любую последовательность ДНК, которая транскрибируется как отдельная единица и кодирует один набор близкородственных полипептидных цепей (изоформ белка). В такое определение гена также входят те последовательности ДНК, которые кодируют варианты белка, получаемые в ходе иных, чем сплайсинг РНК, посттранскрипционных процессов, как например, сдвиг рамки считывания при трансляции (см. рис. 6.78), регулируемое полиаденилирование и редактирование РНК (рассматривается ниже).

7.5.5.  Определение пола дрозофилы зависит от регулируемой последовательности реакций сплайсинга РНК

Обратимся сейчас к одному из самых хорошо изученных примеров регулируемого сплайсинга РНК. У дрозофилы первичным сигналом, определяющим, будет ли муха развиваться как самка или как самец, служит соотношение числа X-хромосом (X) к числу наборов аутосом (A). Если отношение X/A равно 1 (в норме это две X-хромосомы и два набора аутосом), особи развиваются в самок, тогда как особи с отношением X/A, равным 0,5 (в норме одна X-хромосома и два набора аутосом), развиваются как самцы. Это соотношение определяется уже на ранних стадиях развития организма и впоследствии запоминается каждой клеткой. Три ключевых генных продукта передают информацию об этом соотношении множеству других генов, которые определяют характерные для самки и для самца свойства (рис. 7.97). Как объясняется на рис. 7.98, определение пола у дрозофилы зависит от каскада реакций регулируемого сплайсинга РНК, включающих в себя три этих генных продукта.

Глава 7. Контроль генной экспрессии 743

Рис. 7.97. Определение пола у дрозофилы. Приведенные ген-

ные продукты участвуют в последовательном каскаде реакций, отвечающих за определение пола мухи согласно соотношению числа X-хромосом к набору аутосом (X/A). Гены Sex-lethal (Sxl),

Transformer (Tra) и Doublesex (Dsx) получили свои имена в соот-

ветствии с фенотипами, получающимися при их инактивации мутацией. Функция продуктов этих генов состоит в передаче информацииосоотношенииX/Aмножествудругихгенов,определяющих фенотип, характерный для того или иного пола. Эти другие гены функционируют как два альтернативных набора: одниопределяютсвойства,характерныедлясамки,другие—для самца(см.рис.7.98).

Определение пола у дрозофилы представляет один из самых хорошо изученных примеров регуляторного каскада реакций, основанного на сплай-

синге РНК, но остается неясным, почему именно эта стратегия используется у мух. Другие организмы, например нематоды, используют совершенно иную схему для определения пола — основанную на механизмах контроля транскрипции и трансляции. Кроме того, для развития самца требуется непрерывный синтез ряда нефункциональных молекул РНК, что кажется излишне расточительным. Одно из предположений состоит в том, что этот каскад реакций сплайсинга РНК, как и рассмотренные выше рибопереключатели, представляет собой древнюю стратегию контроля, оставшуюся с ранних этапов эволюции, когда РНК была преобладающей биологической молекулой и механизмы контроля экспрессии генов почти полностью основывались на взаимодействиях РНК–РНК.

7.5.6.  Изменение сайта, в котором происходит расщепление транскрипта РНК и его полиаденилирование, может менять карбоксильный конец белка

В главе 6 говорилось, что у эукариот 3′-конец молекулы мРНК формируется не терминацией синтеза РНК РНК-полимеразой, а в ходе реакции расщепления РНК, которая катализируется дополнительными факторами при элонгации транскрипта (см. рис. 6.37). Клетка может контролировать место такого расщепления с тем, чтобы изменить карбоксильный конец получающейся молекулы белка.

Хорошо изученным примером является переключение синтеза антител при созревании B-лимфоцитов с мембраносвязанных на секретируемые формы (см. рис. 25.17). В незрелых B-лимфоцитах образующиеся антитела связаны с плазматической мембраной, где они служат рецепторами антигенов. Стимуляция антигенами запускает деление этих клеток и начало секреции ими антител. Секретируемая форма антител отличается от мембраносвязанной формы только в терминальной части карбоксильного конца: мембраносвязанная форма содержит здесь длинную цепь из гидрофобных аминокислот, пересекающую липидный бислой мембраны, а секретируемая форма несет гораздо более короткий фрагмент гидрофильных аминокислот. Таким образом, для переключения с синтеза мембраносвязанных на секретируемые антитела необходима различная нуклеотидная последовательность на 3′-конце мРНК. Это достигается путем изменения длины первичного РНК-транскрипта в результате смены сайта расщепления РНК, как показано

Глава 7. Контроль генной экспрессии 747

каждой точке, где происходит редактирование, РНК разрезается, к образовавшемуся 3′-концу добавляются урациловые нуклеотиды и РНК лигируется обратно.

Более совершенный вид редактирования РНК встречается у млекопитающих. В данном случае существуют два основных типа редактирования: дезаминирование аденина с образованием инозина (А →I-редактирование) и дезаминирование цитозина с образованием урацила (C → U-редактирование, см. рис. 5.50). Поскольку такие химические модификации меняют свойства спаривания оснований (инозин спаривается с цитозином, а урацил – с аденином), то они могут значительно повлиять на смысл РНК. Если редактирование происходит в кодирующей области, оно может изменить аминокислотную последовательность белка или привести кобразованию усеченного белка. Редактирование, происходящее за пределами кодирующих последовательностей, может повлиять на сплайсинг пре-мРНК, транспорт мРНК из ядра в цитозоль или на эффективность трансляции РНК.

Процесс А →I-редактирования особенно преобладает у человека, где по расчетам затрагивает свыше 1 000 генов. Этот вид редактирования выполняют ферменты, называемые ADAR (аденозиндезаминазы, действующие на РНК). Они узнают двухцепочечную структуру РНК, образованную в результате спаривания участка, подвергающегося редактированию, с комплементарной последовательностью, расположенной где-то на той же самой молекуле мРНК, обычно в интроне на 3′-конце (рис. 7.101). Такие комплементарные последовательности определяют, будет ли редактироваться мРНК или нет и, если ответ положительный, точное место, где это будет происходить. Особенно важный пример А →I-редактирования встречается в случае мРНК, кодирующей медиатор-зависимый ионный канал в мозге. Редактирование заключается только в замене глутамина на аргинин; затронутая аминокислота располагается на внутренней стенке канала и произошедшая при редактировании замена меняет проницаемость канала для Ca2+. Важность такого редактирования была показана на примере мышей, у которых удалили соответствующий ген ADAR. Мутантные мыши были подвержены эпилептическим припадкам и умирали в ходе или вскоре после отнятия от груди. Если вызвать мутацию гена ионного канала, чтобы напрямую образовывалась отредактированная форма белка, мыши, у которых отсутствовал фермент ADAR, развивались нормально, тем самым показывая, что редактирование РНК ионного канала в норме — критичное событие для развития мозга.

C → U-редактирование, осуществляемое другим набором ферментов, также критично для млекопитающих. Например, в определенных клетках кишечника мРНК аполипопротеина B подвергается C →U-редактированию, в результате чего

Рис. 7.101. Механизм А → I-редактирования у млекопи-

тающих. Последовательности РНК, находящиеся на одной итойжемолекулеРНК,обозначаютместоредактирования. Обычно последовательность, комплементарная месту редактирования, располагается на интроне, и образующаяся врезультатедвухцепочечнаяструктураРНКпривлекаетфер- ментADAR,выполняющийА→I-редактирование.Этотвид редактирования происходит в ядре до того, как пре-мРНК будетполностьюпроцессирована.Умышиичеловекаесть три фермента ADAR: ADR1 необходим в печени для нормального развития эритроцитов, ADR2 требуется для нормальногоразвитиямозга(какописановтексте),арольADR3 неопределена.