718 Часть 2. Основные генетические механизмы
няться с другими регуляторными белками, основными факторами транскрипции, медиатором, РНК-полимеразой и ферментами, модифицирующими хроматин.
Важное следствие комбинаторного контроля генов состоит в том, что эффект от введения нового регуляторного белка в клетку будет зависеть от истории клетки, так как именно «прошлое» клетки определяет, какие регуляторные белки уже в ней есть. Таким образом, в ходе развития клетка может накапливать набор регуляторных белков, которые не обязательно сразу же меняют экспрессию генов. Добавление последних членов цепочки из входящих в состав необходимой комбинации регуляторных белков завершает регуляторное «послание» и может приводить к значительным изменениям в экспрессии генов. Подобная схема, как мы видели, помогает объяснить, как добавление одного регуляторного белка в клетку фибробласта может вызвать ее внезапное превращение в мышечную клетку. Возможно, что именно эта схема обусловливает описанные в главе 22 важные различия между процессом детерминации клетки, где клетка становится коммитированной к определенному пути развития, и процессом дифференцировки клетки, где коммитированная клетка проявляет свой специализированный характер.
7.4.11. Один регуляторный белок может запустить образование целого органа
Мы выяснили, что, хотя комбинаторный контроль является нормой для эукариотических генов, один регуляторный белок, если он завершает соответствующую комбинацию белков, может быть решающим при включении или выключении целого набора генов, и мы видели, как это может привести к превращению одного типа клеток
вдругой. Впечатляющее распространение этого принципа было обнаружено при исследованиях развития глаза дрозофилы, мыши и человека. В данном случае ключевым является регуляторный белок, называемый Ey (сокращенно от Eyeless) у мух и Pax6 у позвоночных. При экспрессии в соответствующем окружении Ey может запускать образование не просто одного типа клеток, а целого органа (глаза), состоящего из разных типов клеток, и все они определенным образом организованы в пространстве.
Самое поразительное доказательство ведущей роли белка Ey продемонстрировано в опытах над плодовыми мушками, когда на начальных стадиях развития экспрессию гена Ey вызывали искусственным способом в группах клеток, которые
внорме формируют части ног. Эта аномальная экспрессия генов приводила к развитию глаз на ногах (рис. 7.77).
Глаз дрозофилы состоит из тысяч клеток, и вопрос о том, как регуляторный белок координирует формирование целого органа, является центральной темой биологии развития. Как описывается в главе 22, в этом задействованы как межклеточные взаимодействия, так и внутриклеточные регуляторные белки. Обратите внимание в данном случае на то, что белок Ey напрямую контролирует экспрессию многих других генов посредством связывания с их регуляторными областями. Некоторые из генов, находящихся под контролем Ey, сами кодируют регуляторные белки, которые, в свою очередь, контролируют экспрессию других генов. Кроме того, некоторые из этих регуляторных продуктов генов, в свою очередь, тоже действуют на сам ген Ey, создавая петлю положительной обратной связи, которая обеспечивает непрерывный синтез белка Ey, пока клетки делятся и дифференцируют дальше (рис. 7.78). Таким образом, воздействие только одного регуляторного белка может надолго запустить каскад регуляторных белков и механизмов межклеточного взаимодействия, чьи действия приведут к формированию организованной группы
Глава 7. Контроль генной экспрессии 719
Рис. 7.77. Экспрессия гена Ey дрозофилы вклетках-предшественникахногииницииру- етразвитиеглазананоге.а)Упрощенныесхе-
мы, показывающие результаты нормальной экспрессиигенаEyвличинкеплодовоймушки (слева) и экспрессии гена Ey, вызванной искусственным способом, в клетках, из которыхвнормеразвиваетсятканьноги(справа). б)Фотографияаномальнойногисглазом(см. такжерис.22.2).(б—слюбезногоразрешения
WalterGehring.)
из множества разных типов клеток. Можно представить, как при неоднократном применении этого принципа постепенно выстраивается сложный организм.
7.4.12. При делении клеток позвоночных характер метилирования ДНК может передаваться по наследству
До сих пор подчеркивалась регуляция транскрипции генов белками, которые связываются с ДНК, но и сама ДНК может быть ковалентно модифицирована; и в последующих разделах мы увидим, что это тоже предоставляет возможности
720 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис.7.78.Регуляторныебелки,определяющиеразвитиеглаза удрозофилы.ГеныToy(Twinofeyeless) иEy(Eyeless)кодируют схожиерегуляторныебелки,ToyиEy,каждыйизкоторыхпри их эктопической экспрессии может запускать развитие глаза. При нормальном развитии для экспрессии Ey необходим ген Toy. После активации транскрипции белком Toy белок Ey активирует транскрипцию генов So (Sine oculis) и Eya (Eyes absent), действующих совместно, чтобы включить ген Dac (Dachshund).Зеленымистрелкамиотмечено,чтонекоторые из регуляторных белков образуют серию взаимосвязанных петельположительнойобратнойсвязи,усиливающихпервоначальное коммитирование клеток на развитие глаза. Известно,чтодлятого,чтобыразвилсяглаз,белокEyнапрямую связываетсясмногочисленнымицелевымигенами,включая те,чтокодируюткристаллиныхрусталика,родопсиныидругие фоторецепторныебелки.(АдаптированоизT. Czernyetal.,Mol. Cell3:297–307,1999.СразрешенияElsevier.)
для регуляции экспрессии генов. В клетках позвоночных метилирование цитозина представляет мощный механизм, посредством которого происходит передача профилей экспрессии генов дочерним клеткам. Метилированная форма цитозина, 5-метилцитозин (5-метил-C), имеет то же отношение к цитозину, что и тимин к урацилу, и модификация также не оказывает влияния на спаривание оснований (рис. 7.79). Метилирование ДНК (DNA methylation) у позвоночных ограничивается нуклеотидами цитозина (C) в последовательности CG, которая спарена с точно такой же последовательностью (но в обратной ориентации) на другой цепи ДНК. Следовательно, прямое наследование дочерними цепями ДНК существующего типа метилирования обеспечивается простым механизмом. Фермент, называемый поддер-
живающей метилтрансферазой (maintenance methyltransferase), главным образом действует на те последовательности CG, которые спарены с уже метилированной последовательностью CG. В результате профиль (паттерн) метилирования родительской цепи ДНК служит матрицей для метилирования дочерней цепи, что приводит к тому, что он наследуется непосредственно после репликации ДНК (рис. 7.80).
Стабильное наследование паттернов метилирования ДНК может быть объяснено действием поддерживающей ДНК-метилтрансферазы. Однако профиль метилирования ДНК динамически изменяется в ходе развития позвоночных.
Рис.7.79.Образование5-метилцитозинапроисходитприметилированиицитозинавдвойнойспирали ДНК. У позвоночных этот процесс ограничен цитозиновыми остатками (C), находящимися в последовательностиCG.
Глава 7. Контроль генной экспрессии 721
Рис. 7.80. Как происходит точное наследование профиля метилирования ДНК. В ДНК позвоночных метилирована значительная часть остатков цитозина, входящих в состав последовательности CG (см. рис. 7.79). Благодаря действию метил-зависимого метилирующего фермента (поддерживающей ме- тилтрансферазы)однаждыпроведеннаяразметкаДНК-метильнымигруппаминаследуетсядочерними молекуламиДНК,какпоказанонарисунке.
Вскоре после оплодотворения по геному прокатывается волна деметилирования — и большинство метильных групп ДНК утрачивается. Такое деметилирование может происходить либо путем подавления активности поддерживающей ДНК-метилтрансферазы, в результате чего происходит пассивная потеря метильных групп в ходе каждого цикла репликации ДНК, либо вследствие действия специфического деметилирующего фермента. На более поздних стадиях развития новые типы метилирования образуются при помощи нескольких de novo синтезированных ДНК-метилтрансфераз, направляемых к ДНК сайт-специфическими ДНК-связывающими белками, где они модифицируют соседние неметилированные нуклеотиды CG 12. Как только новые паттерны метилирования установятся, они могут быть распространены в ходе раундов репликации ДНК благодаря действию поддерживающих метилтрансфераз.
Метилирование ДНК может по-разному использоваться в клетках позвоночных. Возможно, его самая важная роль состоит в совместной работе с другими механизмами контроля экспрессии генов с целью создания особо эффективной формы репрессии генов, которая может без ошибок передаваться дочерним клеткам (рис. 7.81). Такая комбинация механизмов гарантирует, что ненужные эукариотические гены можно подавить с высокой эффективностью. Например, интенсивность, с которой транскрибируется ген позвоночных в одной ткани, может отличаться от интенсивности в другой ткани в 106 раз. Неэкспрессируемые гены позвоночных являются намного менее «текучими» в отношении транскрипции, чем гены бактерий, у которых наибольшие известные различия в интенсивности транскрипции экспрессируемых и неэкспрессируемых генов не превышают 1 000 кратный уровень.
Как метилирование ДНК помогает подавлять экспрессию генов, пока не полностью понятно, но выяснены два основных механизма. Метилирование ДНК в области промотора гена или его регуляторных последовательностей может непосредственно
12 В настоящее время показано, что, зачастую «целеуказателем» для метилирования ДНК, равно как и для модификации гистонов, может служить некодирующая РНК — Прим. ред.
722 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис.7.81.Многочисленныемеханизмызадействованыстабильнойрепрессиейгенов.Вэтомсхематич-
номпримерегистоновыебелок-«читатель»ибелок-«писатель»подуправлениемрегуляторныхбелков формируют репрессивную форму хроматина. Заново синтезированная ДНК-метилаза привлекается гистоновым белком-«читателем» и метилирует соседние остатки цитозина на ДНК, к которым, в свою очередь,присоединяютсясвязывающиесясметилированнойДНКбелки.ВходерепликацииДНКнекоторыеизмодифицированных(синяяточка)гистоновбудутнаследоватьсяоднойдочернейхромосомой, некоторые–другой,ивкаждойдочернейклеткеонимогутиндуцироватьреконструкциютогожесамого профилямодификациихроматина(см.рис.5.39).Втожевремямеханизм,приведенныйнарис.7.80,будет приводить к наследованию обеими дочерними хромосомами одинакового профиля метилирования. Двамеханизманаследованиябудутвзаимноусиливатьдействиядругдруга,еслиметилированиеДНК будетстимулироватьактивностьгистоновогобелка-«писателя».Этасхемаможетобъяснитьнаследова- ниедочернимиклеткамимодификацийкакгистонов,такиДНК.Онатакжеможетпояснитьсклонность некоторыхмодификацийхроматинараспространятьсяпохромосоме(см.рис.4.45).
Глава 7. Контроль генной экспрессии 723
помешать связыванию белков, необходимых для инициации транскрипции. Кроме того, в клетке есть набор белков, которые специфически связываются с метилированной ДНК (см. рис. 7.81), таким образом блокируя доступ другим белкам. Одним из отражений важной роли метилирования ДНК для человека является широко распространенная причастность ошибок в этом механизме к развитию рака (см. главу 20).
Позже мы вернемся в этой главе к теме сайленсинга генов посредством метилирования ДНК, когда будем обсуждать инактивацию X-хромосомы и другие примеры крупномасштабного подавления генов. Однако сначала опишем несколько других способов, при помощи которых метилирование ДНК влияет на наш геном.
7.4.13. Геномный импринтинг основан на метилировании ДНК
Клетки млекопитающих являются диплоидными и содержат один набор генов, унаследованный от отца, и один набор генов, унаследованный от матери. Экспрессия небольшой части генов зависит от того, были ли они унаследованы от матери или от отца: пока активна отцовская копия гена, материнская копия гена молчит, и наоборот. Это явление называется геномным импринтингом (genomic imprinting). Ген Igf2 инсулин-подобного фактора роста 2 (insulin-like growth factor-2) считается хорошо изученным примером импринтированного гена. Ген Igf2 необходим для внутриутробного роста; и мыши, у которых он совершено не экспрессируется, рождаются в два раза меньше обычного размера. Однако транскрипция идет только с отцовской копии гена Igf2, и только эта копия имеет значение для фенотипа. В результате мышь с мутантным, полученным от отца геном Igf2 рождается малорослой, тогда как мышь с мутантным геном Igf2, полученным от матери, соответствует норме.
На ранних эмбриональных стадиях развития гены, подвергающиеся импринтингу, метилируются в соответствии с тем, были ли они получены от сперматозоида или от яйцеклетки. Таким образом, метилирование ДНК используется в качестве метки, помогающей различать две копии гена, которые в другом случае были бы идентичными (рис. 7.82). Поскольку импринтированные гены некоторым образом защищены от волны деметилирования, которая происходит вскоре после оплодотворения (см. разд. 7.4.12), такая метка дает возможность соматическим клеткам «запомнить», от какого из родителей получена каждая из двух копий гена, и в соответствии с этим регулировать их экспрессию. В большинстве случаев метилированный участок импринтинга подавляет близлежащую экспрессию, но в некоторых случаях он может активировать экспрессию гена. Например, что касается гена Igf2, метилирование инсуляторного элемента (см. рис. 7.62) на хромосоме, полученной от отца, блокирует его функцию и позволяет отдаленному энхансеру активировать транскрипцию гена Igf2. На материнской хромосоме инсуляторный элемент не метилирован, и поэтому ген Igf2 не транскрибируется
(рис. 7.83).
Почему вообще должен существовать импринтинг, остается загадкой. У позвоночных он ограничен плацентарными млекопитающими и многие из импринтированных генов участвуют в развитии плода. Одна из идей заключается в том, что импринтинг отражает компромисс в эволюционной борьбе между самцами, стремящимися произвести как можно больше потомства, и самками, ограничивающими его размер. Вне зависимости от смысловой нагрузки импринтинг служит поразительным доказательством того, что, помимо нуклеотидной последовательности, могут наследоваться и другие черты ДНК.
724 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис.7.82.Импринтингумыши.Вверхнейчастирисункапоказанапарагомологичныххромосомвсоматическихклеткахдвухвзрослыхмышей:самцаисамки.Вэтомпримереобемышиунаследоваливерхнюю гомологичную хромосому от отца, а нижнюю — от матери, и отцовская копия гена, подвергающаяся импринтингу (показано оранжевым цветом), метилирована, что препятствует ее экспрессии. Копия того же гена, полученная от матери (желтая), экспрессируется. На оставшейся части рисунка показан результатскрещиванияэтихдвухмышей.Входеобразованияполовыхклеток,нодомейоза,импринтинг снимается.Затем,назначительноболеепозднихстадияхпроцессасозреванияполовыхклеток,налагается ужеспецифичныйдлякаждогополаимпринтинг(средняячастьрисунка).Вяйцеклеткахсамкиниодин из аллелей гена A не метилируется, в сперматозоидах самца метилируются оба аллеля. Внизу рисунка показаны два возможных варианта импринтинга, которые наследуются потомством. Мышь слева об- ладаеттемжетипомимпринтинга,чтоиродители,тогдакакмышьсправа—противоположнымтипом. Если два аллеля гена A отличаются, то эти разные варианты импринтинга могут привести к фенотипическимразличиямвпотомстве,несмотрянаточтонесутточнотакиежепоследовательностиДНКдвух аллелейгенаA.Импринтингслужитважнымисключениемизклассическогогенетическогоповедения, и считается, что ему подвержены несколько сотен мышиных генов. Однако большинство генов мыши не подвергаются импринтингу, и, следовательно, к большей части генома мыши применимы законы наследованияМенделя.
Глава 7. Контроль генной экспрессии 725
Рис. 7.83. Механизм импринтинга гена Igf2 мыши. На хромосомах, унаследованных от матери, белок, именуемый CTCF, связывается с инсулятором (см. рис. 7.62), блокируя коммуникацию между энхансером(зеленый)игеномIgf2(оранжевый).Следовательно,белокIgf2неэкспрессируетсясхромосомы,унаследованнойотматери.Вследствиеимпринтингаинсуляторнахромосоме,полученной от отца, метилируется, что приводит к его инактивации из-за блокирования связывания с ним белка CTCF, и позволяет энхансеру активировать транскрипцию гена Igf2. В других примерах импринтинга метилированиепрепятствуетэкспрессиигенов,мешаясвязыватьсябелкам,необходимыхдлятранскрипциигена.
7.4.14. CG-богатые островки есть во многих генах млекопитающих
Входе эволюции метилированные остатки цитозина в геноме имеют тенденцию к исчезновению, что объясняют способом работы ферментов репарации ДНК. Случайное дезаминирование неметилированного цитозина приводит к возникновению урацила (см. рис. 5.45), который в норме не входит в состав ДНК и потому легко распознается ферментом репарации урацил-ДНК-гликозилазой, вырезается
изатем заменяется на цитозин (как описано в главе 5). Но последствия случайного дезаминирования 5-метил-C не могут быть устранены подобным способом, так как при дезаминировании образуется тимин, который не отличим от других, немутантных остатков тимина, входящих в состав ДНК. Существует специальная система репарации, чтобы удалять такие мутантные нуклеотиды тимина, но многие из дезаминированных нуклеотидов остаются незамеченными, так что в ходе эволюции эти метилированные остатки цитозина в геноме имеют тенденцию превращаться в тимин.
Входе эволюции подобным образом было утеряно более трех из каждых четырех CG, что привело к значительному уменьшению содержания этого динуклеотида в геноме позвоночных. Оставшиеся последовательности CG очень неравномерно распределены по геному: существуют отдельные области длиной 1 000–2 000 нуклеотидов, называемые CG-островками (CG islands), в которых содержание CG
в10–20 раз выше, чем в среднем по геному. Подобные островки, за некоторыми важными исключениями, по-видимому, остаются неметилированными во всех типах клеток. Они часто окружают промоторы так называемых генов «домашнего хозяй- ства» (housekeeping genes), то есть тех генов, которые кодируют много белков, необходимых для жизнедеятельности клетки и, следовательно, экспрессируемых
вбольшинстве клеток (рис. 7.84).
726 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис.7.84.CG-островки,окружающиепромоторвтрехгенах«домашнегохозяйства»млекопитающих.
Желтымипрямоугольникамиотмеченразмеркаждогоостровка.Убольшинствагеновмлекопитающих (см. рис. 6.25) экзоны (темно-красные) короче, нежели интроны (розовые). (Адаптировано A. P. Bird,
TrendsGenet.3:342–347,1987.СразрешенияElsevier.)
Распределение CG-островков (также называемых островками CpG, чтобы отличать динуклеотиды CG от пары оснований CG) можно легко объяснить, если предположить, что метилирование CG было первоначально перенято позвоночными как способ поддержания ДНК в транскрипционно неактивном состоянии (см. рис. 7.81). У позвоночных новые мутации метилцитозина в тимин могут передаваться следующему поколению, только если они произошли в зародышевой линии клеток — клеточной линии, которая дает начало сперматозоидам и яйцеклеткам. Большая часть ДНК в половых клетках позвоночных не активна и сильно метилирована.
За долгую эволюцию метилированные последовательности CG в этих неактивных областях, по-видимому, были утеряны в ходе спонтанного дезаминирования, результаты которого не были исправлены. Однако промоторы генов, остающихся активными в половых клетках (включая большинство генов «домашнего хозяйства») остаются неметилированными, и поэтому при спонтанном дезаминировании остатков цитозина, происходящем в них, могут быть безошибочно репарированы. У современных клеток позвоночных подобные области сохранились в виде CG островков (рис. 7.85). Кроме того, любая мутация последовательности CG в геноме, которая нарушала бы функцию или процесс регуляции гена во взрослом организме, подвергалась бы отрицательному отбору, и некоторые CG-островки, по-видимому, являются результатом превышающей норму плотности критических последовательностей CG для этих генов.
Геном млекопитающих содержит приблизительно 20 000 CG-островков. Большинство островков отмечают 5′-концы транскрипционных единиц и таким образом, вероятно, и 5′-концы генов. Так что их наличие предоставляет нам удобный способ идентификации генов в последовательностях ДНК позвоночных.
Глава 7. Контроль генной экспрессии 727
Рис. 7.85. Механизм, объясняющий заметную общую нехватку последовательностей CG и их группирование в островки CG в геномах позвоночных.Чернойлиниейотмеченорасположение динуклеотидов CG в последовательности ДНК,тогдакаккраснойголовкойобозначенаметильная группа на динуклеотиде CG. ПоследовательностиCG,расположенныеврегуляторных последовательностях генов, которые транскрибируютсявполовыхклетках,неметилированыи, следовательно,имеюттенденциюксохранению в ходе эволюции. С другой стороны, метилированныепоследовательностиCGсклонныутрачиваться при дезаминировании 5-метилцитозина в тимин, только если последовательность CG не являетсязначимойдлявыживания.
7.4.15. Эпигенетические механизмы гарантируют передачу дочерним клеткам стабильных профилей экспрессии генов
Как упоминалось выше, в организме, после дифференцировки клетки в определенный клеточный тип, она, как правило, сохраняет свою специализацию, и при делении дочерние клетки наследуют тот же специализированный характер. Например, клетки печени, пигментные клетки и эндотелиальные клетки (описаны в главе 23) делятся множество раз в течение жизни индивидуума, и каждая из них безошибочно образует дочерние клетки того же типа. Подобные дифференцированные клетки должны запоминать свою специфическую картину экспрессии генов и передавать ее своим потомкам в ходе всех последующих клеточных делений.
Мы уже привели несколько способов, позволяющих дочерним клеткам «запоминать», каким типом клеток они обязаны стать. Один из простейших способов — через петлю положительной обратной связи, в которой ключевой регуляторный белок активирует напрямую или косвенно транскрипцию своего собственного гена (см. рис. 7.68 и 7.69). Взаимосвязанные петли положительной обратной связи обеспечивают еще большую стабильность путем буферизации системы цепи против колебаний уровня любого регуляторного белка (рис. 7.75, б и 7.78). Также ранее отмечалось, что метилирование ДНК может служить способом передачи паттернов экспрессии генов потомкам (см. рис. 7.80).
Петли положительной обратной связи и метилирование ДНК распространены как среди бактерий, так и среди эукариот, но эукариотам доступны также и другие способы поддержания дифференцированного состояния клетки в течение множества клеточных делений. Согласно главе 4, структура хроматина может сама по себе безошибочно передаваться от родительской к дочерней клетке. Для этого существует несколько механизмов, но самый простой основан на ковалентной модификации гистонов. Как мы уже выясняли, такие модификации образуют «гистоновый код», содержащий различные типы модификации, которые служат участками связывания различных белков-«читателей». Если эти белки, в свою очередь, действуют как (или
