Volume1

Глава 7. Контроль генной экспрессии 679

РНК-полимеразой II, существуют тысячи различных регуляторных белков. Например, ориентировочно из 25 000 человеческих генов установлено 8 % (около 2 000 генов), кодирующих регуляторные белки. Большинство из них узнают последовательности ДНК, используя один из описанных ранее связывающихся с ДНК мотивов. Неудивительно, что в эукариотической клетке каждый из ее генов регулируется особым способом. При заданном общем количестве генов у эукариот и сложности их регуляции трудно было сформулировать простые правила регуляции генов, применимые во всех случаях. Однако мы смогли сделать несколько обобщений о том, как регуляторные белки, связавшись с контролирующей областью гена на ДНК, запускают последовательность событий, которая приводит к активации или репрессии гена.

Медиатор и общие факторы транскрипции одинаковы для всех генов, которые транскрибирует полимераза II, но регуляторные белки и расположение участков связывания относительно промотора у каждого гена свои.

7.3.8.  Эукариотические белки-активаторы индуцируют сборку РНК-полимеразы и общих факторов транскрипции на сайте инициации транскрипции

Участки ДНК, с которыми связываются эукариотические белки-активаторы, сначала назывались энхансерами, поскольку их присутствие увеличивало интенсивность инициации транскрипции (от англ. enhance — увеличивать, усиливать). Когда же впервые выяснили, что эти белки-активаторы могут связываться за десять тысяч нуклеотидных пар от промотора, это стало полной неожиданностью, но, как мы видели, петлеобразование ДНК дает по крайней мере одно из объяснений этому первоначально загадочному наблюдению.

Самые простые белки-активаторы построены из модулей, состоящих из двух отдельных доменов. Один домен обычно содержит один из рассмотренных ранее структурных мотивов, узнающих специфическую последовательность ДНК. Второй домен,

иногда называемый активирующим транскрипцию доменом (activation domain),

ускоряет интенсивность инициации транскрипции. Такой тип модульной структуры впервые выявлен в экспериментах, где были использованы методы генной инженерии для создания химерного белка, содержащего активирующий транскрипцию домен одного белка и соединенный с ним ДНК-связывающий домен другого белка (рис. 7.45).

Как эукариотический белок-активатор после связывания с ДНК увеличивает интенсивность инициации транскрипции? Как будет скоро видно, существует несколько механизмов, посредством которых это может произойти, и во многих случаях эти различные механизмы согласованно работают на одном промоторе. Но вне зависимости от точного биохимического пути основная функция активаторов состоит в привлечении, позиционировании и модификации общих факторов транскрипции, медиатора и РНК-полимеразы II на промоторе так, чтобы могла начаться транскрипция. Они делают это напрямую, непосредственно действуя на эти компоненты, или косвенно, изменяя структуру хроматина вокруг промотора.

Некоторые белки-активаторы непосредственно связываются с одним или более из общих факторов транскрипции, ускоряя их сборку на промоторе, который связан через ДНК с этим активатором. Другие взаимодействуют с медиатором и привлекают его к ДНК, где он затем может облегчить сборку РНК-полимеразы и общих факторов транскрипции на промоторе (см. рис. 7.44). В этом смысле эукариотические активаторы напоминают активаторы бактерий касательно привлечения РНК-полимеразы к специфическим участкам ДНК, чтобы РНК-полимераза могла начать транскрипцию.

Глава 7. Контроль генной экспрессии 681

прямых действий, направленных на сборку транскрипционного аппарата на промоторе, белки-активаторы также способствуют инициации транскрипции с помощью изменения структуры хроматина в области регуляторных последовательностей и промоторов генов.

Согласно главе 4, четыре из наиболее важных способов локального изменения структуры хроматина состоят в ковалентной модификации гистонов, перестройке нуклеосом, удалении нуклеосом и их замене. Белки-активаторы используют все четыре механизма, привлекая ферменты, модифицирующие гистоны, ATP-зависимые комплексы перестройки хроматина и гистоновые шапероны, чтобы изменить структуру хроматина в области промоторов, которые они контролируют (рис. 7.46). Полагают, что в общих чертах эти локальные изменения в структуре хроматина делают подвергающуюся воздействию ДНК более доступной, таким образом облегчая сборку общих факторов транскрипции, медиатора и РНК-полимеразы на промоторе. Локальная модификация хроматина также дает возможность присоединиться к контролирующей области гена дополнительным регуляторным белкам. Однако

Рис. 7.46. Четыре разных способа, с помощью которых эукариотические белки-активаторы могут управлять локальными изменениями структуры хроматина для стимулирования инициации транс-

крипции.Этимеханизмы,показанныеввидеотдельныхпутей,однако,частомогутработатьсовместно в ходе активации гена. Например, предварительное ацетилирование гистонов упрощает их удаление из нуклеосом при помощи гистоновых шаперонов. На рис. 4.44 показаны несколько профилей модификации гистонов, которые способствуют инициации транскрипции, конкретный пример приведен нарис.7.47.Перестройкануклеосомиудалениегистоновблагоприятствуютинициациитранскрипции, увеличиваядоступностьДНКи,следовательно,облегчаяприсоединениемедиатора,РНК-полимеразы иобщихфакторовтранскрипции,такжекакидополнительныхбелков-активаторов.Процессыинициации транскрипциииобразованиякомпактнойструктурыхроматинаможнорассматриватькакконкурирующие биохимические процессы сборки, а ферменты, которые увеличивают (даже кратковременно) доступностьДНКвхроматинебудутблагоприятствоватьинициациитранскрипции.

682 Часть 2. Основные генетические механизмы

самая важная роль ковалентной модификации гистонов при транскрипции, вероятно, заключатся не в прямом изменении структуры хроматина: скорее всего, как обсуждается в главе 4, эти модификации обеспечивают благоприятные взаимодействия для связывания широкого набора белков, которые считывают «гистоновый код». Что касается инициации транскрипции, то этот набор белков включает другие гистон-модифицирующие ферменты (комплексы «читатель-писатель»), комплексы перестройки хроматина и по крайней мере один из общих факторов транскрипции (рис. 7.47).

Изменения структуры хроматина, происходящие в ходе инициации транскрипции, могут сохраняться в течение различных периодов времени. В некото-

Рис. 7.47. Написание и чтение гистонового кода в ходе инициации транскрипции. В этом приме-

ре,представляющемпромоторгенаинтерферона человека,белок-активаторсвязываетсясупакован- ной в хроматин ДНК и сначала привлекает гистоновую ацетилтрансферазу, чтобы ацетилировать лизин 9 гистона H3 и лизин 8 гистона H4. Далее, гистонкиназа,привлеченнаябелком-активатором, фосфорилирует серин 10 гистона H3, но это возможно только после ацетилирования лизина 9. Затем модификация серина подает сигнал гистоновойацетилтрансферазеацетилироватьлизин14 (K14) на гистоне H3. На этом запись гистонового кода инициации транскрипции завершается. Обратите внимание, что написание кода является последовательным процессом, где каждая модификациягистоназависитотпредыдущей.

Окончательное чтение кода происходит, когда связываются общий фактор транскрипции TFIID икомплексперестройкихроматинаSWI/SNF—оба взначительнойстепенистимулируютпоследующие этапы инициации транскрипции. TFIID и SWI/SNF распознают ацетилированные хвосты гистонов с помощью бромодомена (bromodomain) — белкового домена, специализирующегося на считывании этой конкретной модификации гистонов. Бромодоменрасположеннасубъединицекаждого белковогокомплекса.(АдаптированоизT. Agalioti, G. ChenandD. Thanos,Cell111:381–392,2002.Сраз- решенияElsevier.)

Глава 7. Контроль генной экспрессии 683

рых случаях, как только регуляторный белок отсоединяется от ДНК, происходит быстрое обращение процесса модификации хроматина, возвращающее ген в его состояние до активации. Быстрое восстановление прежней структуры особенно важно для генов, которые должны быстро включаться и выключаться в клетке в ответ на внешние сигналы — как например, глюкокортикоидные гормоны, рассмотренные ранее в этой главе. Однако в других случаях измененная структура хроматина сохраняется даже после того, как регуляторный белок, который управлял ее созданием, отсоединился от ДНК. В принципе, эта память может распространяться и на следующее поколение клеток, поскольку, как обсуждалось в главе 4, структура хроматина может самовоспроизводиться (см. рис. 4.52). Интересно рассмотреть возможность того, что различные модификации гистонов являются устойчивыми в течение различного времени, обеспечивая клетку механизмом долгосрочной, среднесрочной

икраткосрочной памяти относительно профилей экспрессии генов.

Входе транскрипции гена РНК-полимеразой II происходит специальный вид модификации хроматина. В большинстве случаев нуклеосомы — непосредственно впереди полимеразы — ацетилируются комплексами белков-«писателей», которые несет полимераза, удаляются гистоновыми шаперонами и располагаются за движущейся полимеразой. Затем они быстро деацилируются и метилируются также комплексами «писатель-читатель», располагающимися на полимеразе, которая оставляет позади себя нуклеосомы, особо резистентные к транскрипции. Несмотря на то что этот удивительный процесс может показаться нелогичным, он, вероятно, развивался как средство предотвращения ложной реинициации транскрипции позади двигающейся полимеразы, которая, по существу, расчищает себе путь сквозь хроматин. Далее в этой главе, когда будет обсуждаться РНК-интерференция, потенциальная опасность, которую несет клетке подобная «неуместная транскрипция», станет особенно очевидной.

Мы только что убедились в том, что белки-активаторы могут серьезно влиять на структуру хроматина. Однако даже до того, как начинают действовать белкиактиваторы, многие гены находятся «на позиции», готовые к быстрой активации. Например, регуляторные области многих генов имеют «метку» в виде короткой области без нуклеосом, по краям которой расположены нуклеосомы, содержащие гистоновый вариант H2AZ. Такая структура, определяемая последовательностью ДНК, обеспечивает свободный доступ регуляторным белкам к области без нуклеосом. Кроме того, предполагается, что нуклеосомы, содержащие H2AZ, легко диссоциируют, таким образом еще больше облегчая инициацию транскрипции.

7.3.10.  Белки-активаторы взаимно усиливают действие друг друга

Мы уже выяснили, что эукариотические белки-активаторы генов могут влиять на различные этапы инициации транскрипции. В общем случае там, где для повышения скорости реакции совместно действует несколько факторов, их совместный эффект является не простой суммой положительных эффектов, даваемых каждым фактором, а произведением. Например, если фактор A понижает барьер свободной энергии для реакции на определенную величину и таким образом ускоряет реакцию

в100 раз, а фактор B, воздействуя на другую составляющую реакции, делает то же самое, тогда совместное действие A и B снизит барьер вдвое и ускорит реакцию

в10 000 раз. Даже если A и B будут действовать только как агенты, привлекающие один и тот же белок, сродство этого белка к активному центру умножается в разы. Таким образом, белки-активаторы генов часто проявляют транскрипционный си-

684 Часть 2. Основные генетические механизмы

нергизм (transcriptional synergy) — когда несколько белков-активаторов, действуя совместно, увеличивают эффективность инициации транскрипции на величину, значительно превышающую ту, которая была бы получена при простом суммировании их вклада по отдельности (рис. 7.48). Легко заметить, как множество регуляторных белков, каждый из которых связывается с различными регуляторными областями ДНК, работают вместе, чтобы контролировать конечную интенсивность транскрипции эукариотического гена.

Рис. 7.48. Транскрипционный синергизм. В данном опыте сравнивается интенсивность транскрипции, создаваемаявэукариотическойклеткетремярегуляторнымибелками,сконструированнымиэкспериментально, а также показан транскрипционный синергизм, превышающий суммарный эффект от действия множестваактиваторов.Транскрипционныйсинергизмобычнонаблюдаетсямеждуразличнымибелками- активаторамиодногоитогожеорганизмаидажемеждубелками-активаторамиразныхвидовэукариот, еслиихэкспериментальноввестиводнуитужеклетку.Последнеенаблюдениеотражаетвысокуюстепень консерватизмасложногоаппарата,ответственногозаинициациютранскрипцииуэукариот.

Поскольку белки-активаторы могут влиять на множество различных этапов пути, ведущего к активации транскрипции, то стоит рассмотреть, всегда ли эти этапы происходят в установленном порядке. Например, всегда ли модификация гистонов предшествует перестройке хроматина, как в примере на рис. 7.47? Медиатор вступает до или после РНК-полимеразы? Ответы на эти вопросы оказываются различными для разных генов и отличаются даже для одного и того же гена, находящегося под действием разных регуляторных белков (рис. 7.49).

Какими бы ни были точные механизмы и порядок их выполнения, регуляторный белок должен напрямую или косвенно связываться с ДНК, чтобы воздействовать на транскрипцию своего целевого гена, а интенсивность транскрипции гена в конечном счете зависит от спектра регуляторных белков, связывающихся левее или правее его сайта инициации транскрипции.

7.3.11.  Белок-репрессор генов эукариот может ингибировать транскрипцию различными способами

У эукариот, как и у бактерий, для регуляции транскрипции генов используются, помимо белков-активаторов, белки-репрессоры (gene repressor proteins). Однако из-за разницы в способах инициации транскрипции, которые используют эукариоты и бактерии, эукариотические репрессоры обладают значительно более широким набором возможных механизмов действия. Из главы 4 известно, что большие области генома можно выключать путем упаковки ДНК в гетерохроматин. Однако эукариотические гены редко когда располагаются в геноме в соответствии

Глава 7. Контроль генной экспрессии 685

Рис. 7.49. Последовательность событий, ведущая к инициации транскрипции специфиче-

скогогена.Вэтомхорошоизученномпримере, взятом из биологии почкующихся дрожжей S.cerevisiae,этапы,ведущиекинициациитранскрипции, идут в особом порядке, однако этот порядок меняется от гена к гену. Например, у другого гена сначала происходит модификация гистонов с последующим привлечением РНК полимеразы, а затем и комплексов перестройки хроматина. На рис. 7.47 показана еще однавозможнаяпоследовательностьсобытий.

со своей функцией, поэтому эта стратегия является в целом непригодной

для большинства примеров регуляции генов. Вместо этого, большинство эукариотических репрессоров должно работать по схеме «ген за геном». В от-

личие от бактериальных репрессоров, большинство эукариотических репрессоров не конкурирует непосредственно

с РНК-полимеразой за доступ к ДНК, скорее они используют ряд других механизмов, некоторые из которых приведены на рис. 7.50. Как и белки- активаторы, многие белки-репрессоры эукариот воздействуют на заданный ген при помощи более чем одного механизма и, следовательно, обеспечивают надежную и эффективную репрессию.

Репрессия генов особенно важна для животных и растений, чей рост зависит от действия сложно организованных программ развития. Неверная экспрессия единственного гена в критический момент времени может иметь катастрофические последствия для индивидуума. По этой причине многие из генов, кодирующие наиболее важные при развитии организма регуляторные белки, находятся под надежной репрессией, если в них нет необходимости.

7.3.12.  Регуляторные белки эукариот часто кооперативно связываются с ДНК

До настоящего момента мы выяснили, что при связывании эукариотического активатора и репрессора со специфической последовательностью ДНК запускается сложная серия событий, заканчивающихся инициацией транскрипции или, наоборот, ее репрессией. Однако эти белки редко распознают ДНК как индивидуальные полипептиды. В действительности для эффективного связывания с ДНК в эукариотической клетке необходимо несколько сайт-специфических белков ДНК, действующих совместно. Например, два регуляторных белка со слабым сродством друг к другу могут объединиться, чтобы связаться с последовательностью ДНК,

Глава 7. Контроль генной экспрессии 687

иллюстрирует основную важную идею: белок-белковые взаимодействия, которые слишком слабы, чтобы образовывать комплексы в растворе, могут это сделать на ДНК, где последовательность ДНК выступает в качестве очага «кристаллизации», или затравки, для сборки белкового комплекса.

Как показано на рис. 7.51, отдельный регуляторный белок может участвовать в нескольких типах регуляторных комплексов. Например, в одном случае белок может функционировать как часть комплекса, который активирует транскрипцию, а в другом — как часть комплекса, который ее репрессирует. Таким образом, индивидуальные эукариотические регуляторные белки не обязательно являются «чистыми» активаторами или «чистыми» репрессорами, вместо этого, они действуют как регуляторные элементы, используемые для построения комплексов, функция которых зависит от окончательной сборки всех его отдельных компонентов. Окончательная сборка, в свою очередь, зависит как от расположения последовательностей ДНК контролирующей области, так и от определенных регуляторных белков, находящихся в клетке в активной форме. Следовательно, каждый эукариотический ген регулируется «комитетом» белков, и все из них должны присутствовать в клетке, чтобы экспрессия гена была на должном уровне.

В некоторых случаях точная последовательность ДНК, с которой связывается регуляторный белок, может напрямую повлиять на конформацию этого белка и, следовательно, на его последующую транскрипционную активность. Например, связываясь с одним типом последовательности ДНК, белок-рецептор стероидных гормонов взаимодействует с корепрессором и в итоге выключает транскрипцию. При связывании с немного отличающейся последовательностью ДНК он принимает другую конформацию и взаимодействует с коактиватором, таким образом стимулируя транскрипцию.

Рис. 7.51. Регуляторные белки эукариот часто собираются в комплексы на ДНК. На а показаны семь регуляторныхбелков.Природаифункциякомплекса,которыеониобразуют,зависитотспецифической последовательности ДНК, которая служит затравкой для их сборки. На б некоторые образовавшиеся комплексы активируют транскрипцию гена, а другие ее подавляют. Обратите внимание, что красные

изеленыебелки есть и в активирующих, и в репрессирующих комплексах. Белки, которые не связываютсясамостоятельносДНК,нособираютсянадругихсвязывающихсясДНКрегуляторныхбелках,часто называютсякоактиваторамииликорепрессорами.Однакоэтитерминынемноговводятвзаблуждение, потому что они охватывают огромное разнообразие белков, включая гистоновые белки-«читатели»

ибелки-«писатели», комплексы перестройки хроматина и многие другие классы белков. Некоторые белки не обладают собственной активностью, а просто служат в качестве «основы» для привлечения техбелков,которыееюобладают.