Volume1

668 Часть 2. Основные генетические механизмы

Он представляет собой просто короткий участок регуляторной ДНК заданной нуклеотидной последовательности, которая распознается белком-репрессором, в данном случае триптофановым репрессором (tryptophan repressor) — членом семейства белков, содержащих мотив спираль-поворот-спираль (см. рис. 7.11). Промотор и оператор расположены таким образом, что когда триптофановый репрессор занимает оператор, то он блокирует РНК-полимеразе доступ к промотору и тем самым препятствует экспрессии ферментов, синтезирующих триптофан (рис. 7.35).

Рис.7.35.Включениеивыключениетриптофановыхгенов.Есливнутриклеточнаяконцентрациятрипто-

фананизкая,тоРНК-полимеразасвязываетсяспромоторомитранскрибируетпятьгеновтриптофанового оперона(Trp-оперона).Однакоесликонцентрациятриптофанавысокая,тоактивируетсятриптофановый репрессор,которыйсвязываетсясоператоромитемсамымблокируетприсоединениеРНК-полимеразы кпромотору.Когдаконцентрациявнутриклеточноготриптофанаснижается,репрессоросвобождается оттриптофанаистановитсянеактивным,чтопозволяетполимеразеначатьтранскрибироватьэтигены. ПромоторсодержитдваключевыхблокаинформацииопоследовательностиДНК:областипоследова- тельностей-35и-10,выделенныежелтым(см.рис.6.12).

Регуляция блокировки экспрессии генов осуществляется оригинальным способом: чтобы белок-репрессор мог присоединиться к ДНК, с ним должны быть связаны две молекулы триптофана. Как показано на рис. 7.36, связывание с триптофаном изменяет наклон мотива спираль-поворот-спираль в репрессоре, вследствие чего он надлежащим образом входит в большую бороздку ДНК; без триптофана мотив разворачивается внутрь и белок не может связаться с оператором. Таким образом, триптофановый репрессор и оператор представляют собой простой механизм, включающий и выключающий производство ферментов биосинтеза триптофана в зависимости от наличия свободного триптофана.

Поскольку активная, связывающаяся с ДНК форма белка служит для выключения генов, этот способ регуляции генов называется негативной регуляцией (negative control), и регуляторные белки, которые в нем участвуют, называются

репрессорами транскрипции (transcriptional repressors) или белками-репрессорами

(gene repressor proteins).

Глава 7. Контроль генной экспрессии 671

Рис. 7.38. Некоторые регуляторные белки бактерий могут выступать в роли как активаторов, так и репрессоров транскрипции в зависимости от точного расположения их участков связываниясДНК.Вкачествепримера рассмотрим репрессор бактериофага лямбда. Для некоторых генов белок действуеткакактиватортранскрипции, обеспечивая благоприятный контакт для РНК-полимеразы (вверху). У другихгенов(внизу)операторрасположен на одну пару оснований ближе к промотору,и,вместотогочтобыпомогать полимеразе, этот же белок — репрессор в данном случае — конкурирует с ней за связывание с ДНК. Репрессор фагалямбдараспознаетсвойоператор с помощью мотива спираль-поворот- спираль,какпоказанонарис.7.11.

лярный кофактор. Фактически некоторые бактериальные белки, включая CAP и репрессор бактериофага лямбда, могут действовать и как активаторы, и как репрессоры в зависимости от конкретного местоположения распознаваемой ими последовательности ДНК относительно промотора: если участок связывания белка перекрывает промотор, то полимераза не может связаться, и белок действует как репрессор (рис. 7.38).

7.3.3.  Лактозный оперон контролируется активаторами и репрессорами транскрипции

Более сложные типы генетических переключателей сочетают позитивный

инегативный виды контроля. Например, лактозный оперон (Lac-оперон; Lac operon) E. coli, в отличие от Trp-оперона, находится под обоими: отрицательным

иположительным, механизмами регуляции транскрипции, которые реализуются соответственно белком-репрессором Lac-оперона и CAP. В Lac-опероне закодированы белки, необходимые для транспорта дисахарида лактозы внутрь клетки и его расщепления. Как мы уже знаем, CAP позволяет бактериям при отсутствии глюкозы использовать альтернативные источники углерода, как например, лактозу. Однако было бы нерационально для CAP индуцировать экспрессию Lac-оперона, если лактозы нет в наличии, — и Lac-репрессор гарантирует, что при отсутствии лактозы Lac-оперон выключен. Подобный механизм дает возможность регуляторной области Lac-оперона объединять и реагировать на два разных сигнала, так что эффективная экспрессия оперона происходит только при выполнении двух условий: наличие лактозы и отсутствие глюкозы. При любых других из трех возможных сигнальных комбинаций кластер генов остается в выключенном состоянии (рис. 7.39).

Простой принцип действия этого генетического переключателя впервые привлек внимание биологов 50 лет назад. Как объяснялось выше, молекулярная основа механизма действия переключателя была выяснена при помощи комбинации методов генетики и биохимии, что дало первые представления о том, как регулируется экспрессия генов.

Глава 7. Контроль генной экспрессии 673

бразование ДНК (DNA looping). Первоначально считалось, что Lac-оперон содержит только один оператор, но в последующих работах был обнаружен дополнительный, второй оператор, расположенный вблизи. Одна тетрамерная молекула Lac-репрессора может связывать одновременно сразу два оператора, при этом ДНК между ними образует петлю. Способность одновременно связывать два оператора усиливает общее взаимодействие репрессора с ДНК и, таким образом, приводит к возрастанию уровня репрессии в клетке (рис. 7.40).

Рис. 7.40. Петлеобразование ДНК может стабилизировать взаимодействия белок–ДНК. Репрессор

Lac оперона представляет собой тетрамер, который может одновременно связываться с двумя операторами. Лактозный оперон имеет в общей сложности три оператора, но для простоты здесь показаны толькодва:основнойоператор(Оm)идополнительныйоператор(Оa).Нарисункеизображенывсевозможные состояния Lac-репрессора, связанного с этими двумя операторами. При заданных концентрацияхрепрессоравклеткеиприотсутствиилактозысамымстабильнымбудетсостояние,изображенное снизу справа; и чтобы полностью отсоединиться от ДНК, Lac-репрессор должен сначала пройти через переходноесостояние,гдеонсвязантолькосоднимоператором.Вэтихсостоянияхлокальнаяконцентрация Lac-репрессора очень высока по отношению к свободному оператору, и реакция смещается в сторону образования двусвязной формы белка, а не его диссоциации. Таким образом, даже участки снизкимсродством(Оa)могутувеличиватьзаполняемостьвысокоаффинныхучастков(Оm)иусиливать репрессию генов в клетке. (Адаптировано из J. M. G. Vilar and S. Leibler, J. Mol. Biol. 331: 981–989, 2003. СразрешенияAcademicPress.)

Петлеобразование ДНК позволяет также быстро установить контакт между двумя разными белками, связавшимися вдоль двойной спирали ДНК. ДНК можно представить в виде «привязи», помогающей одному связавшемуся с ДНК белку взаимодействовать с другим, несмотря на тысячи нуклеотидных пар, которые могут разделять участки их связывания (рис. 7.41). Далее будет видно, что петлеобразование ДНК особенно важно при регуляции генов эукариот, хотя и играет ключевую роль во многих других случаях регуляции бактериальных генов — не только в Lac-опероне. Например, петлеобразование ДНК позволяет белку-активатору NtrC без труда напрямую контактировать с РНК-полимеразой, несмотря на то что два этих белка связываются с ДНК на расстоянии в несколько сотен пар нуклеотидов друг от друга (рис. 7.42).

Обозначение сигма-факторов основано на их приблизительном молекулярном весе в килодальтонах.

Рис. 7.43. Взаимозаменяемые субъединицы РНК-полимеразы как стратегия контроля экспрессии генов у бактериофага. Бактериальный вирус SPO1, который заражает бактерию B. subtilis, использует полимеразу бактерий для транскрипции своих ранних генов сразу после того, как вирусная ДНК попадает в клетку. Один из ранних генов, именуемый 28, кодирует сигма-подобный фактор, который связывается с РНК-полимеразой и вытесняет бактериальный сигма-фактор. Новая форма полимеразы специфическиинициируеттранскрипцию«средних»геноввирусаSPO1.Одинизсреднихгеновкодирует второйсигма-подобныйфактор,34,которыйзамещаетпродуктгена28иориентируетРНК-полимеразу на транскрипцию «поздних» генов. На основе этого последнего набора генов синтезируются белки, которыеукладываютхромосомувирусаввируснуюоболочкуилизируютклетку.Приданнойстратегии наборы вирусных генов экспрессируются в порядке своей необходимости, что гарантирует быструю иэффективнуюрепликациювируса.

7.3.6.  Сложные генные переключатели эволюционировали, чтобы контролировать транскрипцию генов эукариот

Принципы регуляции генов бактерий и эукариот во многом одинаковы, включая ключевую роль регуляторных белков, прочно связывающихся с короткими участками ДНК, важность слабых белок-белковых взаимодействий в активации генов, а также гибкость, возможную благодаря петлеобразованию ДНК. Однако по сравнению с прокариотами в регуляции генов эукариот участвуют намного больше белков и более длинные отрезки ДНК, а сама регуляция часто кажется невообразимо сложной. Эта повышенная сложность служит важным преимуществом эукариотической клетки. Генетические переключатели у бактерий, как было отмечено, обычно реагируют на один или несколько сигналов. Но для эукариот вполне обычным является поступление десятка сигналов на один промотор и аппарат транскрипции, суммирующий все эти различные сигналы, чтобы образовать соответствующее ко-

Глава 7. Контроль генной экспрессии 677

личество мРНК. Начнем наше описание регуляции генов у эукариот с выделения основных особенностей, которые отличают ее от регуляции у бактерий.

В главе 6 шла речь о том, что для эукариотической РНК-полимеразы II, которая транскрибирует все кодирующие белок гены, необходимо пять общих факторов транскрипции (в целом 27 субъединиц, см. табл. 6.3, стр. 525), а для бактериальной РНК-полимеразы требуется только один фактор транскрипции — σ-субъединица. Как мы видели, пошаговая сборка общих факторов транскрипции на эукариотическом промоторе предоставляет, в принципе, множество этапов, на которых клетка может увеличить или уменьшить частоту инициации транскрипции в ответ на действие регуляторных белков.

У эукариотических клеток нет оперонов — наборов связанных генов, транскрибируемых как одно целое, следовательно, каждый ген регулируется отдельно.

Каждый бактериальный ген обычно контролируется одним или несколькими регуляторными белками, но для эукариот является типичным контроль гена множеством (иногда сотнями) различных регуляторных белков. Такая сложность организации становится возможной, поскольку, как мы увидим далее, многие эукариотические регуляторные белки могут действовать через очень большие расстояния (десятки тысяч нуклеотидных пар), что позволяет практически бесконечному числу белков влиять на единственный ген.

Основным компонентом системы регуляции генов у эукариот является ме- диатор (mediator) — комплекс из 24 субъединиц, служащий посредником между регуляторными белками и РНК-полимеразой (см. рис. 6.19). Медиатор обеспечивает более широкую площадь контакта для регуляторных белков по сравнению с той, которую предоставляет в одиночку одна лишь РНК-полимераза у бактерий.

Упаковка эукариотической ДНК в хроматин дает множество возможностей для регуляции транскрипции, что не доступно для бактерий.

Общие факторы транскрипции РНК-полимеразы II были рассмотрены в главе 6 (см. разд. 6.1.7–6.1.8), а здесь мы сконцентрируем свое внимание на последних четырех описанных особенностях и на том, как они используются для контроля экспрессии генов у эукариот.

7.3.7.  Контролирующая область гена эукариот состоит из промотора и регуляторных последовательностей ДНК

Поскольку типичный эукариотический регуляторный белок контролирует транскрипцию, связываясь с ДНК вдали от промотора, последовательности ДНК, которые контролируют экспрессию гена, часто распределены вдоль длинных отрезков ДНК.

Мы используем термин контролирующая область гена (gene control region) для опи-

сания всего отрезка ДНК, участвующего в регулировании и инициации транскрипции гена, включая промотор (promoter), где происходит сборка общих факторов транс-

крипции и полимеразы, а также все регуляторные последовательности (regulatory sequences), с которыми связываются регуляторные белки для контроля скорости процессов сборки на промоторе (рис. 7.44). Вполне обычным является обнаружение у животных и растений регуляторных последовательностей гена, рассеянных на таких больших расстояниях, как 50 000 нуклеотидных пар. Большинство подобной ДНК служит в качестве «спейсерных» последовательностей, которые регуляторные белки напрямую не распознают, но она придает гибкость, необходимую для эффективного петлеобразования ДНК. В данном случае важно помнить о том, что, как и другие области эукариотических хромосом, большая часть ДНК в контролирующих об-