Volume1
.pdf
348 Часть 2. Основные генетические механизмы
страивающие белки работают слаженно как в деле деконденсации, так и в деле конденсации протяженных отрезков хроматина – по мере того как считывающий белок движется по упакованной в нуклеосомы ДНК (рис. 4.46).
Рис.4.46.Каккомплекс,содержащийсчитывающие,записывающиеиАТР-зависимыебелкиперестрой- кихроматина,можетраспространятьизменениявхроматинепохромосоме.а)Распространяющаяся волнауплотненияхроматина.Этотмеханизмидентиченпредставленномунарис.4.45,заисключением того, что комплекс считывающих–записывающих белков сотрудничает с АТР-зависимым белком перестройкихроматина(см.рис.4.29)дляперемещениянуклеосомиупаковкиихввысококонденсированную материю.Этокрайнеупрощенноепредставлениеданногомеханизма,который,какизвестно,способен распространять мажорную форму гетерохроматина на значительные расстояния по хромосомам (см. рис.4.36).СпецифичныйкгетерохроматинубелокHP1играетглавнуюрольвтомпроцессе.HP1связываетсястриметиллизином9нагистонеH3иостаетсясвязаннымсуплотненнымхроматиномвкачестве одногоизсчитывающихбелковвкомплексе«чтения-записи-перестройки»,который,хотяинеполностью понят, является значительно более замысловатым, чем показанный здесь. б) Фактическая структура комплекса«чтения-перестройки»хроматина,показывающая,какон,какдумают,взаимодействуетсну- клеосомой. Окрашенная серым модель демонстрирует RSC-комплекс дрожжей, который содержит 15 субъединиц—включаяATP-зависимыйбелокперестройкихроматинаипокрайнеймере4субъединицы сосчитывающимикоддоменами.(ИзображениебзаимствованоизA. E. Leschzineretal.,Proc.Natl.Acad. Sci.USA.104:4913–4918,2007.СлюбезногоразрешенияNationalAcademyofSciences.)
Глава 4. ДНК, хромосомы и геномы 349
Некоторое представление о сложности только что описанных процессов может быть получено из результатов генетических скринингов мутантных генов, которые или усиливают, или подавляют распространение и стабильность гетерохроматина в испытаниях на мозаичный эффект положения у дрозофилы (см. рис. 4.37). Как было упомянуто ранее, известно более 50 таких генов, и большинство из них, вероятно, «работает» в виде субъединиц в одном или нескольких комплексах считывающих-записывающих-перестраивающих белков.
4.3.7. Барьерные последовательности ДНК блокируют распространение комплексов белков «чтение-запись» и тем самым разделяют соседствующие хроматиновые домены
Вышеупомянутый механизм распространения хроматиновых структур вызывает у исследователей следующий вопрос. Поскольку каждая хромосома состоит из одной непрерывной и очень длинной молекулы ДНК, совершенно неясно, что предотвращает какофонию перекрестных помех между смежными хроматиновыми доменами с различной структурой и функцией? Первоначальные исследования мозаичного эффекта положения предложили такой ответ: существуют определенные последовательности ДНК, которые отделяют один хроматиновый домен от другого (см. рис. 4.37). К настоящему времени несколько таких барьерных последовательностей идентифицировано и охарактеризовано с помощью методов генной инженерии, которые позволяют удалять или добавлять к хромосомам определенные области последовательности ДНК.
Например, последовательность под названием HS4 обычно отделяет активный хроматиновый домен, который содержит локус β-глобина, от смежной области заглушенного, конденсированного хроматина в эритоцитах (см. рис. 7.61). Если эта последовательность удалена, то в локус β-глобина вторгается конденсированный хроматин. Этот хроматин заглушает гены, которые он охватывает, и в разных клетках распространяется на различное расстояние, порождая картину эффекта положения, подобную наблюдаемой у дрозофилы. Как будет описано в главе 7, такое вторжение имеет печальные последствия: гены глобина экспрессируются вяло, и у индивидов с такой делецией наблюдается тяжелая форма анемии.
Часто к обоим концам гена, который экспериментально встраивают в геном млекопитающих, добавляют последовательность HS4, чтобы защитить этот ген от умолкания, вызываемого распространяющимся гетерохроматином. Анализ этой барьерной последовательности показывает, что она содержит группу участков связывания ферментов гистонацетилаз. Поскольку ацетилирование боковой цепи лизина несовместимо с метилированием той же боковой цепи, гистонацетилазы и гистондезацетилазы — логически объяснимые кандидаты на образование барьеров в ДНК — барьеров, которые блокируют распространение различных форм хроматина (рис. 4.47). Однако известно и несколько других типов модификаций хроматина, которые также могут защищать гены от умолкания.
4.3.8. Хроматин в центромерах раскрывает механизм образования особых структур разновидностями гистонов
Присутствие нуклеосом, несущих разновидности гистонов, как думают, служит специфическими метками в хроматине, которые необычайно устойчивы. Рассмотрим, например, формирование и наследование хроматина, который образуется
350 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис. 4.47. Некоторые механизмы действия барьера. Эти модели построены на основе результатов различныхисследованийпоизучениюмеханизмовдействиябарьераитого,каксочетаниенескольких из них может функционировать в любом участке. а) Прикрепление области хроматина к большому закрепленному участку, такому как ядерный поровый комплекс, изображенный здесь, может создать барьер,которыйостанавливаетраспространениегетерохроматина.б)Сильноесвязываниебарьерных белковсгруппойнуклеосомможетконкурироватьсраспространениемгетерохроматина.в)Спомощью группыоченьактивныхмодифицирующихгистоныферментовбарьерымогутстеретьгистоновыеметки, которыенеобходимыдляраспространениягетерохроматина.Например,болееуспешноеацетилирование лизина 9 на гистоне H3 конкурирует с метилированием лизина 9 и таким образом предотвращает связываниебелкаHP1,чтонеобходимодляобразованиянекоторыхформгетерохроматина(см.рис.4.46). (ИллюстрациисозданынаосновеA. G. WestandP. Fraser,Hum.Mol.Genet.14:R101–R111,2005.Слюбез-
ногоразрешенияиздательстваOxfordUniversityPress.)
на центромерах — областях ДНК на каждой хромосоме, необходимых для организованного расхождения хромосом по дочерним клеткам при каждом делении материнской клетки (см. рис. 4.21). Во многих сложных организмах, в том числе человека, каждая центромера встроена в отрезок специального центромерного гетерохроматина, который сохраняется на всем протяжении интерфазы, даже при том, что опосредствованное центромерой движение ДНК происходит только во время митоза. Этот хроматин содержит специфичную к центромере разновидность гистона H3, известную как CENP-A (см. рис. 4.41), плюс дополнительные белки, которые упаковывают нуклеосомы в особенно плотные структуры и образуют кинетохор — специальную структуру, необходимую для прикрепления митотического веретена деления.
Специфическая последовательность ДНК приблизительно из 125 пар нуклеотидов достаточна, чтобы служить центромерой у дрожжей S. cerevisiae. Несмотря
Глава 4. ДНК, хромосомы и геномы 351
на ее небольшой размер, более дюжины различных белков собирается на этой последовательности ДНК; в число этих белков входит разновидность CENP-A гистона H3, которая, наряду с тремя другими стержневыми гистонами, образует центромероспецифичную нуклеосому. Дополнительные белки в центромере дрожжей прикрепляют эту нуклеосому к единственной микротрубочке митотического веретена деления дрожжей (рис. 4.48).
Рис. 4.48. Модель структуры простой центромеры. У дрожжей Saccharomyces cerevisiae специальная последовательность центромерной ДНК собирает единственную нуклеосому, в которой две копии разновидности гистона H3 (названного CENP-A в большинстве организмов) заменяют нормальный гистон H3. Затем пептидные последовательности, уникальные для этой разновидности гистона (см. рис. 4.41), помогают собирать дополнительные белки, некоторые из которых образуют кинетохор. Этот кинетохор необычен тем, что захватывает только одну микротрубочку; у человека намного более крупные центромеры и кинетохоры способны захватывать 20 и более микротрубочек (см. рис. 4.50). Кинетохор подробно будет рассмотрен в главе 17. (Переработано на основе A. Joglekar et al., Nat. Cell Biol.8:381–383,2006.СлюбезногоразрешенияMacmillanPublishersLtd.)
Центромеры в более сложных организмах значительно крупнее, чем таковые в почкующихся дрожжах. Например, центромеры мухи и человека простираются на сотни тысяч пар нуклеотидов и, кажется, не содержат специфичную к центромере последовательность ДНК. Эти центромеры в основном состоят из коротких повторяющихся последовательностей ДНК, известных у человека под названием α-сателлитной ДНК. Но те же повторяющиеся последовательности обнаружены также и в других (нецентромерных) позициях на хромосомах, а это указывает на то, что их недостаточно, чтобы направлять формирование центромеры. Что наиболее поразительно, в некоторых необычных случаях наблюдалось, как на фрагментированных хромосомах человека самопроизвольно формируются новые центромеры, названные неоцентромерами. Некоторые из этих новых позиций были первоначально эухроматиновыми и совершенно не содержали α-сателлитную ДНК (рис. 4.49).
352 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис.4.49.Свидетельствопластичностиформированияцентромеручеловека.а)РядобогащенныхA–T
парами последовательностей α-сателлитной ДНК повторяется много тысяч раз во всех центромерах (красный) хромосом человека, окруженных прицентромерным гетерохроматином (коричневый цвет). Однакоиз-задревнегособытияразрываивоссоединенияхромосомынекоторыехромосомычеловека содержат два блока α-сателлитной ДНК, каждый из которых предположительно функционировал как центромера в его исходной хромосоме. Обычно такие дицентрические хромосомы не размножаются устойчиво, потому что они неправильно прикрепляются к веретену деления и разрываются во время митоза.Однаковтеххромосомах,которыеостаютсяцелыми,однаизцентромертакилииначеинактивирована, даже при том, что она содержит все необходимые последовательности ДНК. Это позволяет хромосомеустойчиворазмножаться.б)Умалойдоли(1/2000)потомковчеловекавклеткахнаблюдаются лишниехромосомы.Некоторыеизтакихлишниххромосом,которыеобразовалисьврезультатесобытия разрыва,совершеннонеимеютα-сателлитнойДНК,ивсеженовыецентромеры(неоцентромеры)воз- никаютизтого,чтобылопервоначальноэухроматиновойДНК.
Поэтому кажется, что в сложных организмах центромеры предопределяются сборкой белков, а не специфической последовательностью ДНК. Когда для исследования растянутых волокон хромосомы из области центромеры используют антитела, которые позволяют окрасить специфически модифицированные нуклеосомы, наблюдается поразительное чередование двух модифицированных форм хроматина (рис. 4.50). Видимо, такая организация позволяет центромерному гетерохроматину свернуться таким образом, чтобы поместить CENP-A-содержащие нуклеосомы на внешней стороне митотической хромосомы, где они связывают набор белков, которые формируют кинетохорные пластинки. Эти пластинки, в свою очередь, захватывают группу микротрубочек митотического веретена деления, чтобы точно разделить хромосомы, как будет описано в главе 17.
4.3.9. Структуры хроматина наследуются напрямую
Чтобы объяснить вышеупомянутые наблюдения, было высказано предположение о том, что для формирования центромеры de novo требуется первоначальное событие – затравка, – суть которого заключается в формировании специализированной ДНК-белковой структуры, содержащей нуклеосомы, образованные при участии разновидности CENP-A гистона H3. У человека такое событие затравки происходит легче в массивах α-сателлитной ДНК, чем в других последовательностях ДНК. Тетрамеры H3–H4 от каждой нуклеосомы на родительской спирали ДНК напря-
Глава 4. ДНК, хромосомы и геномы 353
Рис.4.50.Организацияифункцияхроматина,изкоторогоформируютсяцентромеры у человека. а) При окраши-
вании растянутых волокон хроматина флуоресцентно-меченымиантителами α-сателлитнаяДНК,изкоторойформи- руетсяцентромерныйгетерохроматин у человека, видна упакованной в чередующиеся блоки хроматина. Один блоксформированиздлиннойцепочки нуклеосом, содержащих CENP-A вариант гистона H3 (зеленый); другой блок содержит нуклеосомы, которые специально помечены диметиллизином4(красный).Каждыйблоксостоит изболеетысячинуклеосом.б)Модель организации двух типов центромерного гетерохроматина. Как и у дрожжей, нуклеосомы, которые содержат разновидностьгистонаH3,формируют кинетохор. в) Расположение центромерногоиприцентромерногогетерохроматина на метафазной хромосоме человека;изображениеполученоспомощьюфлуоресцентноймикроскопии
сиспользованием тех же антител, что
ина изображении а. (Переработано
из B. A. Sullivan and G. H. Karpen, Nut. Struct. Mol. Biol. 11: 1076–1083, 2004.
С любезного разрешения Macmillan PublishersLtd.)
мую наследуются дочерними спиралями ДНК в репликационной вилке (см. рис. 5.38). Поэтому, как только набор со-
держащих CENP-А нуклеосом собран на отрезке ДНК, легко понять, как новая центромера может далее формироваться — в том же самом месте на обеих дочерних хромосомах после каждого цикла деления клетки
(рис. 4.51).
Пластичность центромер может давать им важное эволюционное преимущество. Мы увидели, что хромосомы эволюционируют частично за счет событий разрыва и воссоединения (см. рис. 4.18). Многие из таких событий дают хромосомы с двумя центромерами или же фрагменты хромосом вообще без центромер. Хотя редко, но инактивация центромер и их способность активироваться de novo может позволить недавно сформированным хромосомам поддерживать центромеры в устойчивом состоянии и таким образом облегчать процесс эволюции хромосомы.
354 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис. 4.51. Модель прямого наследования центромерного гетерохроматина. а) Нормальная сборка хроматинанадвухдочернихспираляхДНК,осуществляемаяврепликационнойвилке,требуетпомеще- ниядимеровH2A–H2BвтетрамерыH3–H4,наследуемыенапрямую,атакжесборкиновыхгистоновых октамеров (см.подробностинарис. 5.38). б) В центромеренаследованиететрамеров«разновидность H3–H4» служит затравкой для формирования новых гистоновых октамеров, которые, таким образом, содержат разновидность гистона H3. Подобный процесс затравки может привести к наследованию смежных блоков центромерного гетерохроматина (содержащих гистон H3, диметилированный по лизину4;см.рис.4.50).Хотяподробностинеизвестны,впроцессзатравки,вероятно,вовлеченыидругие центромерныебелки,которыенаследуютсянарядуснуклеосомами(см.рис.4.52).
Есть некоторые поразительные подобия между формированием и поддержанием центромер и формированием и поддержанием других областей гетерохроматина. В частности, полноценная центромера образуется, в сущности, как «все или ничего», что предполагает в высшей степени кооперативное присоединение белков после события затравки. Более того, будучи сформирована, эта структура, кажется, напрямую наследуется вместе с самой ДНК в каждом цикле репликации хромосомы.
4.3.10. Структуры хроматина обусловливают уникальные свойства хромосом эукариот
Хотя многое еще остается неизученным в функциях различных структур хроматина, упаковка ДНК в нуклеосомы была, вероятно, определяющим шагом в эволюции эукариот наподобие нас с вами. Появление сложных многоклеточных организмов, казалось бы, возможно только в том случае, если клетки в различных последовательностях клеточных поколений будут специализироваться путем изменения доступности и быстроты реагирования многих сотен генов для нужд
Глава 4. ДНК, хромосомы и геномы 355
генетического считывания. Как будет описано в главе 22, каждая клетка сохранит память о своей прошлой истории развития в цепях регуляции, которые управляют многими ее генами.
Хотя бактериям тоже нужны механизмы памяти клетки, сложность запоминающих цепей, необходимых высшим эукариотам, беспрецедентна. Упаковка избранных областей геномов эукариот в различные формы хроматина делает возможным существование механизма памяти клетки такого типа, который не доступен бактериям. Фундаментальная особенность этой уникальной для эукариот формы регулирования генов — хранение памяти о состоянии гена на основе «ген за геном», а именно в форме локальных структур хроматина, которые могут сохраняться в течение различных отрезков времени. На одном полюсе находятся структуры наподобие центромерного гетерохроматина, которые устойчиво наследуются от одного поколения клеток к следующему (см. рис. 4.51). Имеющие много общего с ними механизмы, которые по аналогии основаны на прямом наследовании родительских форм хроматина дочерними спиралями ДНК позади репликационной вилки, как думают, отвечают за другие типы конденсированного хроматина (рис. 4.52). Например, постоянно заглушенный, классический тип гетерохроматина содержит белок HP1, тогда как конденсированный хроматин, который охватывает важные регуляторные гены, связанные с развитием, поддер-
Рис. 4.52. Как упаковка ДНК в хроматине может быть унаследована в ходе репликации хромосомы.
ВэтоймоделинекоторыеизспециализированныхкомпонентовхроматинараспределяютсяповсемдочернимхромосомампослеудвоенияДНК,нарядусоспециальнопомеченныминуклеосомами,которые онисвязывают.ПослерепликацииДНКунаследованныенуклеосомы,которыемодифицированыособым образом,действуясовместносунаследованнымикомпонентамихроматина,изменяюткартинумодификациигистоноввнедавносформированныхдочернихнуклеосомахвблизлежащейкнимобласти.Это создаетновыеучасткисвязываниядлятехжекомпонентовхроматина,которыесюдасобираютсяиза- вершаютструктуру.Последнийпроцесс,вероятно,вовлекаеткомплексы«чтения-записи-перестройки», работающиепосхеме,подобнойпредставленнойранеенарис.4.46.
356 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис. 4.53. Принципиальная схема памяти клетки, хранимой в виде основанной на хроматине эпигенетической ин-
формации в генах эукариот. Гены в клетках эукариот могут бытьупакованывбольшоеразнообразиеразличныхструктур хроматина,обозначенныхздесьразнымицветами.Покрайнеймеренекоторыеизтакихструктурхроматинаоказывают наэкспрессиюгеновособоевоздействие,котороеможетбыть напрямую унаследовано в виде эпигенетической информацииприделенииклетки.Этопозволяетчастирегулирующих гены белков, которые обусловливают различные состояния генов, действовать только единожды, поскольку состояние запоминаетсяпослетого,какрегуляторныйбелокушел.Эпигенетическая информация может сохраняться также в сетях сигнальных молекул, которые управляют экспрессией генов
(см.рис.7.86).
живается группой белков polycomb. Гетерохроматин последнего типа заглушает большое число генов, которые кодируют регуляторные белки генов на ранних этапах развития
зародыша, охватывая в общем около 2 процентов генома человека, и удаляется, только когда каждый индивидуальный ген необходим развивающемуся организму (обсудим в главе 22). Хотя существуют и другие типы наследуемых структур хроматина, еще не совсем ясно, сколько вообще имеется их различных типов: это число определенно может превышать 10 (см. разд. 4.4.3). Фундаментальное значение этого механизма для различения разных генов схематично представлено на рис. 4.53.
Другие формы хроматина могут иметь более короткий жизненный цикл, намного меньший, чем время деления клетки; однако для многих характерно удивительное постоянство, которое помогает опосредствовать биологическую функцию.
Заключение
Несмотря на однородность сборки хромосомной ДНК в нуклеосомах, в организмах эукариот возможно большое разнообразие различных структур хроматина. В основе этого разнообразия лежит большой набор обратимых ковалентных модификаций всех четырех гистонов, составляющих стержень нуклеосомы. Эти модификации включают моно-, ди- и триметилирование многих различных боковых цепей лизина — очень важная реакция, которая не совместима с ацетилированием тех же лизинов. Определенные комбинации модификаций «помечают» каждую нуклеосому «гистоновым кодом». Гисто- новый код считывается, когда белковые модули, которые являются частью более крупного белкового комплекса, связываются с модифицированными ну-
клеосомами в области хроматина. После этого такие код-считывающие белки привлекают дополнительные белки, которые катализируют биологически значимые функции.
Некоторые комплексы код-считывающих белков содержат модифицирующий гистоны фермент, такой как гистонметилаза, который «записывает» ту же метку, что опознал «читатель» кода. Комплекс «чтения-записи-перестройки»
Глава 4. ДНК, хромосомы и геномы 357
такого типа может распространять определенную форму хроматина по хромо- соме на большие расстояния. В частности, большие области конденсированного гетерохроматина, как думают, образуются именно таким образом. Гетерох- роматин обычно встречается вокруг центромеры и около теломер, но может присутствовать также и во многих других позициях хромосом. Плотная упа- ковка ДНК в гетерохроматине обычно заглушает гены в его пределах.
Явление мозаичного эффекта положения представляет хорошее доказа- тельство прямого наследования конденсированных форм хроматина дочерними спиралями ДНК, образованными в репликационной вилке; и подобный этому механизм, кажется, отвечает за поддержание специализированного хроматина
в центромерах. Если смотреть шире, способность передавать определенные структуры хроматина от одного поколения клеток следующему обеспечи- вает основу эпигенетического процесса памяти клетки, который, по всей вероятности, является определяюще важным для поддержания сложного на- бора различных состояний клетки, необходимых сложным многоклеточным организмам.
4.4. Глобальная структура хромосом
Рассмотрев молекулы ДНК и белка, из которых образуется 30-нм хроматиновое волокно, мы обратимся к организации хромосомы в более глобальном масштабе. В виде 30-нм волокна типичная хромосома человека все еще была бы 0,1 см в длину, то есть более чем в 100 раз длиннее ядра клетки. Ясно, что должен существовать еще более высокий уровень укладки, даже в интерфазных хромосомах. Хотя молекулярная основа такой упаковки более высокого порядка все еще в значительной мере остается тайной, она почти наверняка заключается в свертывании 30-нм волокна в ряд петель и катушек. Такая упаковка хроматина неустойчивая и часто изменяется в ответ на потребности клетки.
Мы начнем с описания некоторых необычных интерфазных хромосом, которые могут быть легко изображены, поскольку некоторые особенности этих исключительных случаев, как думают, являются характерными для всех интерфазных хромосом. Более того, они представляют уникальное средство исследования некоторых фундаментальных вопросов о структуре хроматина, поставленных в предыдущем параграфе. Затем мы опишем, как типичная интерфазная хромосома устроена в ядре клетки, сосредоточив внимание на клетках человека. Наконец, мы завершим наш обзор обсуждением дополнительного десятикратного уплотнения, которому интерфазные хромосомы подвергаются во время процесса митоза.
4.4.1. Хромосомы свернуты в крупные петли хроматина
Представление о структуре хромосом в интерфазных клетках было получено в ходе исследований плотных и распростертых спаренных в мейозе хромосом в растущих ооцитах (незрелых яйцеклетках) земноводных. Эти очень необычные хромосомы типа ламповой щетки (наибольшие из известных хромосом) ясно видны даже в световой микроскоп, где они имеют вид организованного ряда больших петель хроматина, отходящих от линейной оси хромосомы (рис. 4.54).
Организация хромосомы типа ламповой щетки показана на рис. 4.55. Всякая отдельно взятая петля всегда содержит одну и ту же последовательность ДНК и на всем протяжении роста ооцита остается развернутой в одной и той же степени.