Контрольные вопросы

1. Основы метода спектрального анализа. Применение данного метода в биологии.

2. Что такое спектр поглощения?

3. От каких факторов зависит форма спектра поглощения?

4. Закон Ламберта – Бэра.

5. Что такое молярный коэффициент экстинкции? В каких единицах он измеряется?

6. Строение фотосинтетических пигментов.

7. Каким образом связаны величины оптической плотности и коэффициента пропускания?

Лабораторная работа № 3 измерение осмотической устойчивости эритроцитов

Цель работы: изучение метода светорассеяния и определение осмотической устойчивости эритроцитов.

Приборы и принадлежности

Фотоэлектрический колориметр (ФЭК), пипетка, микропипетка, растворы NаСl различной концентрации, суспензия эритроцитов в фосфатном буфере.

Эритроциты – клетки крови, содержащие гемоглобин, представляют собой двояковогнутые дискоциты. При помещении эритроцита в гипотонический раствор поваренной соли NаСl на его мембране создается градиент осмотического давления, под действием которого вода проникает внутрь клетки. В результате этого эритроцит «разбухает», принимает форму шара. Дальнейшее увеличение объема приводит к нарушению целостности мембраны и разрушению эритроцита – лизису. При этом содержащийся в эритроцитах гемоглобин выходит в окружающую среду. Описанный процесс называется осмотическим гемолизом.

Разрушение каждого отдельного эритроцита имеет вероятностный характер, так как зависит от многих случайных факторов: состояния мембраны, возраста клетки, температуры и т. д. Поэтому для количественной характеристики процесса гемолиза вводят статистический параметр – осмотическую устойчивость эритроцитов (С_0,5). Осмотической устойчивостью эритроцитов называется концентрация соли NаСl, при которой лизирует 50% клеток, содержащихся в суспензии.

Для определения осмотической устойчивости в данной работе используется турбидиметрический метод, который основан на явлении светорассеяния (рис. 3).

Рис. 3. Схема установки

Свет от источника 1 проходит через светофильтр 2 и попадает в кювету 3, содержащую суспензию эритроцитов, где происходит его рассеяние и поглощение.

Коэффициент пропускания Т равен выраженному в процентах отношению интенсивности I света, вышедшего из кюветы, к интенсивности I₀ света, входящего в нее

T=.

Чем больше нелизированных клеток содержится в суспензии, тем больше интенсивность рассеянного света, а следовательно, меньше интенсивность света, проходящего через кювету, и коэффициент пропускания. При увеличении количества разрушенных эритроцитов рассеяние света уменьшается, а коэффициент пропускания увеличивается. Таким образом, по степени мутности суспензии и величине коэффициента пропускания можно оценить количество лизированных эритроцитов и определить их осмотическую устойчивость.

Для определения осмотической устойчивости строят график зависимости коэффициента пропускания Т от концентрации С раствора NаСl в суспензии эритроцитов (рис. 4). Справа от графика проводят еще одну вертикальную ось, на которой откладывают величину

Р= , где т – число нелизированных эритроцитов, содержащих­ся в суспензии, п – общее число эритроцитов в данной суспензии, Р – вероятность того, что при данной концентрации раствора NаСl не лизировало определенное количество эритроцитов. Считая, что при С = 0 (дистиллированная вода) лизируют все клетки и Р = О, а при С=0,9% (изотонический раствор) все эритроциты целы и Р = 1, можно проградуировать ось Р и, отложив на ней значение Р = 0,5, определить по графику соответствующую этому значению концентрацию раствора NаСl, т. е. осмотическую устойчивость эритроцитов С _0,5.

Рис. 4. Зависимость коэффициента пропускания Т от концентрации С раствора NаСl

Для уменьшения влияния поглощения света измерения производятся при красном светофильтре 670 нм, который соответствует минимуму поглощения гемоглобина.