Филиппович Ю.Б. - Основы Биохимии

АI1инокислоты Рuбонуклеозuдтрифосфоты

ДНК-I1атрица ранскрипция

РНI<-полuмераза иНформации

Амино*тРН!(

Рис. 93. Общая схема матричного биосинтеза белковых тел

(пояснение в тексте)

Как будет показано ниже, наряду с матричным механизмом в природе

существует мультиэнзимный путь биосинтеза белков и пептидов, где специфи­

ческое чередование аминокислот обеспечивается расположением каталитиче­

ски активных белков в мультиэнзимном комплексе.

Матричный механизм биосинтеза беJЖОВ. Общая схема матричного биосин­

теза белковых тел представлена на рис. 93. Она складывается из трех подгото­

вительных процессов-переноса вещества, энергии и информации в рибосому, и главного центрального процесса-сборки полипептидных цепей в рибосоме. Один из элементов указанной схемы (правая верхняя часть рисунка)-транс­

крипция (переписывание) информации о порядке расположения аминокислот­

ных остатков в молекуле синтезируемого белка-рассмотрен ранее. Известно,

что информация об этом закодирована в генетическом аппарате клетки после­ довательностью дезоксирибонуклеотидных остатков в молекуле ДИК. Будучи преобразована (транскрибирована) в последовательность рибонуклеотидных остатков в информативной части молекулы мРИК, синтезированной на ДИК

вкачестве матрицы, эта информация о первичной структуре белка поступает

врибосому. Здесь она переводится (транслируется) с полинуклеотидной после­

довательности в аминокислотную последовательность новообразуемого в ри­ босомальном аппарате белка. Два других процесса-перенос вещества (18 протеиногенных аминокислот и двух амидов) и .перенос энергии, необ­

ходимой для синтеза пептидных связей (левая верхняя часть рисунка), равно

как и наиболее сложный процесс-сборка полипептидной цепи в активной, транслирующей рибосоме (центральная часть рисунка), нуждаются в деталь­

ной характеристике. Она дана ниже.

Активирование аминокислот и перенос их в рибосому. Син­

тез пептидной связи из свободных аминокислот протекает с поглощением

280

энергии в количестве около 12 кДж/моль. В связи с этим давно уже была

высказана идея о сопряженности биосинтеза белка с окислительными процес­ сами (А. В. Благовещенский, М. п. Юргенсон, 1937) или с распадом соедине­ ний, содержащих макроэргические связи (Ф. Липман, 1941). Развитие послед­

него направления привело к обнаружению ферментативного процесса активиро­ вання аминокислот. В 1955 г. М. ХоглеIЩ впервые предложил общепринятую сейчас двухэтапную схему этой реакции.

Первый ее этап состоит во взаимодействии аминокислоты с АТФ, в резуль­

тате чего возникает аминоациладенилат и выделяется пирофосфат. Гидролити­ ческий распад последнего при участии пирофосфатазы обеспечивает необ­

ратимость реакции образования аминоациладенилата. Химизм реакции этого

этапа активирования аминокислот рассмотрен ранее (гл. 111) при характерис­

тике лигаз, катализирующих синтез С-О-связей (см. с. 137). Второй этап

сводится к переносу аминокислоты с образовавшегося аминоациладенилата на

концевой аденозин акцептирующего стебля тРНК:

Как видно из структурной формулы аминоациладенилата, он представляет ангидрид аминокислоты и остатка фосфорной кислоты аденози~-5'-фосфата,

причем донором кислорода для ангидридной связи является ОН-группа карбок­ сила аминокислоты. Будучи ангидридами, свободные аминоациладенилаты

с исключительной легкостью вступают в реакцию с аминокислотами даже при

очень небольшой концентрации (10-3 моль), при почти нейтральной реакции

средЫ (рН 7,4). Реакция осуществляется без участия ферментов и сопровождается образованием пептидных связей. Столь же энергично они ацилируют свободные,

достlпные аминогруппы белковой молекулы. В то же время в СfJязанном

с ферментом состоянии аминоациладенилаты крайне инертны, и об их использо­

вании для синтеза белка прямо из состава комплекса не может быть речи.

Специфичность реакции активирования аминокислот по вьnпеуказанной схеме близка к абсолютной. Ее оценивают как сверхспецифнчвостъ. Активиру­

ются изомеры аминокислот только природного L-ряда; D-изомеры аминокис­ лот в реакцию не вступают. Однако некоторые гомологи L-амино:кислот активируются наряду с белковыми L-аминокислотами.

281

Каталитическое ускорение активироваШlЯ каждой протеиногенной амино­

кислоты осуществляется собствеины,' специфичным только ДЛЯ данной амино­ кислоты фермеитом. Эти ферменты обнаружены у представителей различных

классов животных, растеШlЙ (в том числе водорослей) и микроорганизмов,

т. е. они распространены повсеместно. Это указывает на их важнейшую роль

в биосинтезе белков.

Активирующие ферменты изолируют при низкой температуре из так назы­

ваемой pH5-фракции надосадочной жидкости. Последнюю получают после

улътрацентрифугирования разведенного гомогената клеток при 105000 g в те­

чение 1 ч, в результате чего все структурные элементы клеточного содержимо­ го осаждаются. При подкислении надосадочной жидкости СНзСООН (НСl денатурирует ферменты) до рН 5,3 из нее выпадает осадок, содержащий смесь активирующих аминокислоты ферментов. Поэтому первоначально их назы­

вали pHS-ферментами. В соответствии с современной номенклатурой их

называют аминоацил-тРНК-синтетазами (АРСазами).

Из работ последних лет следует, что аминоацил-тРНК-синтетазы в клетках

существуют в виде высокомолекулярных комплексов-кодосом. При констан­

те седиментации 26-29S и М -1,4 мегаДа эти комплексы включают несколь­

ко АРСаз (специфичных, например, к ала, гли, глу, лей и сер или к лиз, мет,

арг, лей и три) и ферменты, модифицирующие АРСазы и регулирующие их

активность-протеинкиназы, метилтрансферазы, АДФ-рибозилтрансферазы,

фосфопротеинфосфатазы и др.

Ферменты, активирующие аминокислоты, исключительно лабилъны, они легко денатурируются с потерей активност"И. Даже разрушение клеток ультра­

звуком при выделении энзиматического препарата и непродолжительное хра­

нение ведут к их инактивации. Для нормальной деятельности активирующих

аминокислоты ферментов необходимо присутствие в реакционной среде

Mg2 +, так как связывание АТФ идет по имидазольному радикалу гистидина

активного центра .фермента через ион магния.

Молекулярные массы большинства АРСаз (их выделено в высокоочищен­

ном состоянии более 50) близки к 100000, хотя в отдельных случаях достигают 200000 и более (глицил- и фенилаланил-тРНК-синтетазы). Молекулы у боль­ шей части АРСаз являются димерами или тетрамерами (иногда-тримерами)

илишь у единичных АРСаз (например, у аланил-, аргинил-, аспартил-, валил­

иизолейцил-тРНК-синтетаз) представлены одной полиnептидной цепью,

включающей примерно 1000 аминокислотных остатков. Характерно, что

у АРСаз с димерной структурой субъединицы работают сопряженно: высво­

бождение синтезированной аминоацил-тРНК с одной из них происходит в тот

момент, когда к другой вслед за АТФ и аминокислотой присоединяется тРНК.

Следовательно, каждая субъединица в молекуле АРСазы обладает тремя структурно обособленными центрами связывания перечисленных субстратов,

причем посадка каждого предшествующего субстрата облегчает акцептирова­

вие последующего. Поэтому в процессе аминоацилирования тРНК легко возникают тройные фермент-субстgатиые комплексы. Наименее прочно с АР­

Сазами связывается АТФ (к.= 10- моль), на порядок ЛJ'чше-аминокислоты

(K.=10- S моль) и наиболее мощно-тРНК (К.=10моль). АРСазы'-са­

мые «медленные» ферменты; их молекулярная активность составляет от не­

сколысих десятков до нескольких сотен каталитических актов в 1 мин.

Исходя из изучения различными методами активных центров АРСаз и ис­

следования кинетики ускоряемых ими реакций активирования аминокислот,'

начал проясняться механизм их действия. Первой к АРСазе присоединяется АТФ, аденилирующая остаток гистидина в активном центре фермента с выде­ лением пирофосфата:

282

АРСаза

С аденилированной АРСазой взаимодействует активируемая при ее по­ средстве аминокислота, в результате чего возникает аминоациладенилат. По­

следний, обладая выдающейся способностью аминоацилировать любые ради­

калы, содержащие подвижный атом водорода, передает аминоацильную груп­ пу на радикал гистидина активного центра АРСазы, в результате чего образуется аМflиоацилировзнный фермент:

E~H2-C-CH,

1 /N -CO-CH! -NH1 N==CH

После связывания ферментом соответствующей тРНК аминоацильная

группа передается на ОН-группу остатка аденозина ее акцептирующего конца

(уравнение реакции см. с. 281). У некоторых АРСаз роль остатка гистидина

восуществлении приведенных выше этапов активирования аминокислоты

может играть радикал глутаминовой кислоты.

При образовании фермент-субстратного комплекса из АРСазы и тРНК

и та и другая претерпевают конформационные перестройки, облегчающие реакцию аминоацилирования. Однако самым существенным и интригующим

моментом взаимодействия АРСазы и тРНК является их способность безоши­ бочно узнавать друг друга в соответствии с абсолютиой специфичностью к той

или иной аминокислоте. По-видимому, она базируется на многоточечном взаимодействии фермента и тРНК, причем существенная роль в узнавании

Долгое время считали, что аминоацильная группа всегда присоединяется

ПО ОН-группе 3'-углеродного атома рибuзы концевого аденозина молекулы

тРНК. Оказалось, что иногда эту же функцию может выполнять гидроксил 2'-углероДного атома остатка рибозы. Это наблюдается при активировании фенилаланина, лейдина и изолейцина при участии соответствующих АРСаз. В противоположность этому серил- и треонил-тРНК-синтетазы обеспечивают

присоединеlШе аминоацильных групп только .по 3'-углеродному атому

283

рибозы, а тирозин- и цистеин-тРНК-лигазы-по 2'- и по 3'-углеродным атомам. Установлено также, что аминоацильная группа в аминоацил-тРНК

способна перемещаться от 2'- к 3'-углеродному атому рибозы и наоборот,

вплоть до установления равновесия:

Полагают, что аминоацилирование тРНК либо в 2'-, либо в 3'-положении

остатка рибозы концевого аденозина' предупреждает от ошибок при активиро­ вании стереохимически близких аминокислот (например, валина и треонина).

Впрочем, если даже ошибка произошла, т. е. вместо специфической для дан­ ной тРНК аминокислоты к ней присоединилась какая-то иная, АРСаза может

исправить ошибку сама, так как обладает способностью гидролизовать чуж­

дые ей неспецифические аминоациладенилаты.

Таким образом в процессе активирования неуклонно обеспечивается строго избирательное присоединение каждой аминокислоты к специфичной для нее

284

· мРНк. Взаимодействие кодонов мРНК с антикодонами аминоацил-тРНК

предопределяет порядок чередования аминокислотых остатков в синтезируе­

мом по матричной схеме белке. Это принципиально важное положение доказа­

но экспериментально и известно как «опыт Шапвиля» (по имени одного из ученых, участвовавших в его проведении). В этом опыте цистеинил-тРНК путем

восстановления по аминоацильному остатку была превращена в аланил-тРНК:

Синтезированная так аланил-тРНКЦИС содержит остаток аланина, присое­ диненный к тРНК, несущей антикодон цистеина. Когда ее ,ввели в белоксин­ тезирующую систему, в полипептидной цепи образующегося белка позиции цистеина оказались занятыми остатками аланина. Это однозначно указывает

на то, что именно тРНК кодирует вступление соединенного с ней аминоациль­

ного остатка в заданное положение в новообразуемой белковой молекуле.

Поэтому аминоацил-тРНК-синтетазы одно время называли кодазами или

шифразами; однако комиссия по номенклатуре ферментов не рекомендовала

использовать эти термины, и их сейчас не употребляют.

Ма тричный механизм сборки полипептидной цепи. Биосин­

тез белков во всех структурных элементах клетки (ядро, митохондрии, хлоро­ пласты, эндоплазматический ретикулум и др.) идет на рибосомах. Поэтому именно на пути исследования структуры и свойств рибосом, а также механиз­ ма их взаимодействия с исходнь~и для биосинтеза белков соединениями достигнуты наиболее впечатляющие результаты в выявлении закономерно­ стей новообразования белковых тел.

Строение и свойства рибосом. Рибосомы-мельчайшие тельца

рибонуклеопротеиновой природы. Они содержатся в основном в цитоплазме растительных, животных и бактериальных клеток в количестве нескольких десятков тысяч в каждой.

Рибосомы выделяют путем дифференциального центрифугирования кле­

точного содержимого, получаемого после гомогенизации клеток. Известно,

что этим путем удается разделить клеточное содержимое на ряд фракций (см.

гл. 1). Рибосомы связаны главным образом с мембранами эндоплазматиче­ ской сети. Поэтому при фракционировании содержимого клетки они осажда­ ются вместе с обломками липопротеиновой мембраны-микросомами.

Для выделения рибосом микросомы обрабатывают дезоксихолатом-ре­

агентом, растворяющим липиды и, следовательно, разрушающим микросо­

мы; затем рибосомы осаждают в изотонических буферных растворах центри­

фугированием при 100000 g в течение 1 ч. При разрушении других субклеточ­

ных частиц (ядра, пластиды, митохоидрии) из них также могут быть выделены

рибосомы. В настоящее время выделение рибосом осуществлено из многочис­

ленных объектов-представителей животного и растительного мира, а также

микроорганизмов. Форма и структура рибосом, выделенных из разных источ­

ников, сходна, но по значению константы седиментации их делят на два

класса: 70S и 80S. Первые найдены у всех прокариот, а также содержатся

в ядрах, митохондриях и хлоропластах эукариот; вторые локализованы в ци­ топлазме только эукариот.

димеры или слипаются в более крупные агрегаты, а при понижении до

285

0,0001 М диссоциируют на субчастицы: 70(80)S~30(40)S+50(60)S. Этот про..

цесс диссоциации-ассоциации рибосом и их субчастиц-контролируется также полиаминами (см. 'с. 211) и изменением концентрации друmхдвухва·

лентныx катионов.

Будучи исключительно рибонуклеопротеинами (их называют также РНП·. частицами), рибосомы составлены из почти равных количеств РНК и белка,

варьирующих в зависимости от класса рибосом (табл. 22) с определенно выраженной тенденцией к некоторому преобладанию в них белка.

Кроме белков и нуклеиновых кислот, в составе рибосом в ничтожных

количествах обнаружены дрymе вещества: Mg 2 + и CO Z +, ди. и полиамины,

ряд других катионов (Ре3+, Zn 2 +, А13 +, ВаН, SrZ+, NiZ+. Cr z+, NH:),

а также латентная рибонyicлеаза.

Рибосомы в нативном состоянии, т. е. в живых клетках, сильно mдратиро·

ваны: так. на 1 г сухого вещества рибосом из ретикулоцитов приходится 2.7 г

гидротационной воды. Это свидетельствует об исключительно высокой «по­ ристости» нативных рибосом.

Белок и РНК в рибосомных частицах соединены очень непрочными

связями: уже при инкубации с 0,5-1 М растворами солей при низкой темпера­

туре происходит отделение белка от нуклеиновой кислоты. Аналогичная

диссоциация происходит, например, при рН12 в условиях электрофореза. Связи белков с нуклеииовыми кислотами в рибосомах оцеиивают в основном как

электростатические. Высокое содержание в суммарных рибосомальных белках

O~HOBHЫX аминокислот (12% лизина, 11 % аргинина и 3% гистидина), заряжен­

ных положительно, и большое число межнуклеотидных Фосфатов в ри60СО­

мальных РНК, заряженных отрицательно, обеспечивают условия для возник­

новения достаточного количества ионных связей между первыми и вторыми.

Структура и функция рибосомальных высокомолекулярных(16-18 и 23-28S)

инизкомолекулярных(5S и 5,8S) РНК рассмотрена ранее (см. гл. VI). Что касается

структуры и функции рибосомальных белков, то об этом в последние годы

получена сушественная информация. Как видно из табл. 22, и малыIe (30-40S),

ибольшие (50-60S) субчастицы рибосом содержат в своем составе строго определенное число белков, крайнеrетерогенныхпо молекулярныммассам. Белки,

локализованные в малых (30-40S) субчастицахрибосом, обозначают буквойS (от

анrл. smo/l-малыЙ). в больших (50-60S)-L (от франц. lагgе-большоЙ).

Благодаря применению современных методов белковой химии все белки из

рибосом кишечной палочки получены в высокоочищенном гомогенном со­

crоянии. у всех у них определены первичные структуры, у многих из них­

вторичные и третичные структуры. Как правило, молекулы рибосомальных

белков асимметричны, характеризуются наличием значительного количества

286

А

ской области)-здесь под ру­ ководством акад. А. С. Сnиpина выполнены фундаментальные исследования

рибосомального аппарата клетки. Топология рибосом представлена на рис. 96. Сейчас ясно, что основу пространственного строения рибосом задает третичная структура 16-18S и 23-28S рНК, предопределяющая форму и конструкцию 30-40S и 50-60S субчастиц рибосомы соответственно. Это

особенно ярко выступает при анализе данных, полученных при выяснении строения 30S субчастицы рибосомы кишечнОй палочки А. С. Спириным И сотр. Оказалось, что морфолоmческая модель 30S субчастицы предопреде­ ляется 16S рРНК, находящейся в компактной форме, с которой взаимодей­

ствуют и располагаются на ней в определенных позициях белк~ SI - S21,

найденные в этой субчастице (рис. 97). Аналогично построена 50S субчастица

рибосомы кишечной палочки.

Принципиальное значение для понимания того, как в рибосоме идет синтез

белка, имеют данные о локализации в ней центров, где осуществляются важнейшие этапы биосинтеза полипептИДНОЙ цепи: связывание аминоацил­

тРНК, связывание белковых факторов, необходимых для функционирования

рибосомы, считывание информации о порядке расположения аминокислотных

остатков в новообразуемом белке, синтез пептидной связи, удаление тРНК,

высвобождающейся после образования пептидной связи, перенос пептидил­

тРНК из аминоацильного центра в пептидильный центр с одновременным

продвижением мРНК на один триплет нуклеотидных остатков, гидролиз

сложноэФИРНОЙ связи между полипептидом и тРНК в момент завершения

синтеза белка в рибосоме и др. Поэтому рассмотрение современных представ­

лений о структуре рибосомы логично завершить дaннымil о функциональной

модели рибосомы (Г. Виттман и др., 1974), где показаны ее Функцион~ные

центры (рис. 98).

Механизм биосинтеза белка в рибосоме. Схема, иллюстрирую­

щая механизм биосинтеза белка в рибосоме, npедставлена на рис. 99. Она

288

16$ РНК

10/fM

I

А

Рис. 97. Пространственная структура 3OS-субчастицы рибосомы кИIlIеч­

ной палочки:

А-морфолоrичесхав модель; Б-расположение белжО8 и РНК в соответствии с моделью

(белки, Н8ХОДjlщиеся на заднем плане. заштрихованы)

П-центр А-центр