Вопрос 21.

Методы культивирования вирусов.

Культивирование вирусов производят для накопления вируссодержащего материала с целью изучения различных свойств вирусов, а также для приготовления биологических препаратов.

Методы культивирования вирусов:

1. Культивирование на естественно-восприимчивых и лабораторных животных.

Влияют на чувствительность животных к вирусам следующие факторы:

- возраст. Наиболее восприимчивы молодые животные (мышата, крольчата), так как у них нет системы защиты организма.

- наличие неспецифических ингибиторов, которые выполняют защитную функцию организма. У молодых животных низкое содержание ингибиторов.

- пол животных. Наиболее чувствительны особи женского пола.

- генетические линии. Одни животные более чувствительны, другие – резистентны. Например, наиболее восприимчивы к большинству нейротропных вирусов мыши, поэтому пассажи чаще проводятся на белых мышах.

Недостатки культивирования вирусов в организме животных:

- не все вирусы культивируются в организмах лабораторных животных;

- лабораторные животные потенциально могут быть носителями различных скрытых инфекционных заболеваний;

- материальные затраты на кормление и содержание животных.

2. Культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах.

Наиболее доступный и удобный метод. В основе метода лежит удаление эмбриона до яйца в период, когда к его скорлупе изнутри полностью прилегает хорион-аллантоисная оболочка. Если внутрь такого яйца добавить питательную среду, то образуется своеобразная культура ткани, в которой может репродуцироваться вирус.

Несколько способов заражения куриных эмбрионов:

- на хорион-аллантоисную оболочку;

- в аллантоисную полость;

- в амниотическую полость;

- в желточный мешок.

Недостатки метода:

- куриные эмбрионы могут быть носителями микроорганизмов, в том числе вирусов и противовирусных антител;

- не все вирусы культивируются в куриных эмбрионах.

3. Культивирование вирусов на культурах тканей и клеток (см вопрос 22)

Применяют в следующих случаях:

- для замены лабораторных и домашних животных;

- получения большого количества вирусов, необходимых для производства биологических препаратов;

- изучения развития вирусов в зараженных клетках.

Вопрос 22.

Понятие о культуре клеток. Их классификация и практическое применение.

Под культурой ткани и клеток понимают кусочки органов и тканей или отдельные их клетки, которые сохраняют жизнедеятельность и способность размножаться в питательной среде вне организма.

Для роста и размножения клеток вне организма необходим комплекс физико-химических факторов (оптимальная температура, осмотическое давление среды, газовая среда, солевой состав питательной среды, присутствие в среде ионов Na, K, Ca, Mg, Cl, карбонатов и фосфатов, pH 7.2……7.4, аминокислоты, глюкоза, витамины группы В, чистота и стабильность компонентов).

Культуры тканей различают в зависимости от условий выращивания клеток:

1. Культуры переживающих тканей в жидкой среде и на агаре, которые или вообще не размножаются in vitro, или дают очень слабый рост, т.е. в них отсутствует процесс размножения клеток. Заражение вирусом производят в момент их приготовления.

2. Культуры растущих тканей или клеток, активно размножающиеся in vitro при благоприятных условиях питания.

Используют, главным образом, 3 типа клеток:

1. Первичная культура – происходящая от клеток тканей или организмов, взятых непосредственно из организма. Культура считается первичной, пока ее не субкультивируют, после чего она становится клеточной линией. В ряде случаев первичная культура обладает более высокой чувствительностью к вирусам, по сравнению с клеточными линиями.

Приготовление первичных культур клеток включает: получение ткани, выделение клеток, выращивание однослойной культуры.

2. Линия клеток – первичная культура со времени получения субкультуры. Могут иметь ограниченный срок жизни in vitro, а могут размножаться неограниченно долго (становятся непрерывными клеточными линиями).

Линия диплоидных клеток. Морфологически однородная популяция клеток. Такие культуры часто называют штаммами. Штамм клеток – популяция однородных клеток, сохраняющая специфические свойства в течение ограниченного периода культивирования. Для нее характерны:

- стабильность в процессе культивирования in vitro;

- по крайней мере 75% клеток обладает кариотипом нормальных клеток исходного вида;

- ограниченный срок жизни;

- наличие фаз стабилизации, активного роста и старения;

- сохранение в процессе пассирования содержания каротина на уровне исходной ткани;

- на всем протяжении культивирования сохраняется доброкачественный характер;

- свободны от микоплазм и скрытых вирусов;

- обладают широким спектром чувствительности к вирусам, что позволяет выращивать в них большинство видов вирусов.

Линия гетероплоидных клеток. Клеточная линия имеет менее 75% клеток с диплоидным набором хромосом.

3. Постоянная (непрерывная) клеточная линия. Клетки способны к размножению вне организма неопределенно длительное время. Широко распространен термин «перевиваемые клетки».

Преимущества перевиваемых клеток:

- независимость от источников тканей, так как клетки пересеваются бесконечно;

- на клетки не влияют большие концентрации антибиотиков;

- соответствие стандартному состоянию.

Недостатки:

- безграничный рост – свойство опухолевых клеток;

- быстрое наступление деструктивных изменений;

- при длительном культивировании часто подвергаются изменчивости.

Существенный недостаток тканевых культур, осложняющий их применение в вирусологической диагностике – частое загрязнение исходного тканевого материала латентными вирусами, микоплазмами.