- •Вирусология. Этапы развития и связь с другими науками.
- •2. Природа и происхождение вирусов, уникальные черты, отличающие вирусы от других инфекционных агентов.
- •3.Место и роль вирусов в биосфере, сходство с другими формами жизни, роль в патологии животных и человека.
- •5. Химический состав вирионов вирусов.
- •6. Структура вирионов (нуклеоид, нуклеокапсид, капсид, капсомеры, суперкапсид, Моболочка). Типы симметрии вирусных частиц, простые и сложные вирионы.
- •7. Нуклеиновые кислоты вирусов, их строение и функции, отличие от клеточных. Типы вирусных геномов.
- •8. Вирусные белки, их виды, свойства и функции, отличие от клеточных.
- •9. Основные принципы систематики и номенклатуры вирусов.
- •10. Краткая характеристика семейств безоболочечных днк-содержащих вирусов.
- •11.Краткая характеристика семейств оболочечных днк-содержащих вирусов.
- •12.Краткая характеристика семейств безоболочечных рнк-содержащих вирусов.
- •13.Краткая характеристика семейств оболочечных рнк-содержащих вирусов с позитивным геномом.
- •14.Краткая характеристика семейств оболочечных рнк-содержащих вирусов с негативным геномом.
- •15.Стадии репродукции вирусов: адсорбция, проникновение, депротеинизация.
- •1. Начало инфекции (эклипс-фаза, теневая фаза)
- •16.Стадии репродукции вирусов: экспрессия вирусного генома (транскрипция, трансляция вирусных белков, репликация генома).
- •2. Экспрессия вирусного генома
- •17.Стадии репродукции вирусов: сборка вирионов и выход их из клетки.
- •18.Культивирование вирусов в организме естественно восприимчивых и лабораторных животных.
- •19.Культивирование вирусов на куриных эмбрионах.
- •20.Культивирование вирусов на культурах клеток и тканей, преимущества клеточных культур перед лабораторными животными и куриными эмбрионами, значение в вирусологии.
- •21.Виды культур клеток: органные, первично-трипсинизированные, диплоидные и перевиваемые; их свойства, особенности, области применения.
- •22.Действие на вирусы физических и химических факторов (температура, ультрафиолетовое облучение, кислоты, щелочи, жирорастворители, антибиотики). Методы уничтожения и консервации вирусов.
- •23.Пути и формы циркуляции вирусов в природе, сохранение популяции вирусов в межэпизоотический период.
- •24.Влияние антропогенных факторов на циркуляцию вирусов (загрязнение окружающей среды, использование вакцин, химиопрепаратов, пестицидов, концентрация животных и др.).
- •25.Генотип и фенотип вирусов. Наследственность, изменчивость, эволюция вирусов, генофонд вирусной популяции.
- •26.Генетические и негенетические взаимодействия вирусов.
- •27.Спонтанные и индуцированные мутации вирусов. Методы селекции и клонирования вирусов, отбор мутантов и их использование в профилактике вирусных болезней.
- •28. Классификация вирусных инфекций на уровне клетки. Цитопатология зараженной клетки.
- •29. Тропизм вирусов, проникновение в организм и распределение в нем. Классификация вирусных инфекций на уровне организма.
- •30. Клеточные и гуморальные факторы противовирусного иммунитета, их формирование, взаимодействие, значение для организма.
- •31. Иммунный ответ хозяина на вирусную инфекцию, особенности противовирусного иммунитета. Типы вирусных антигенов.
- •32. Иммунопатология вирусных инфекций, способы "ускользания" вирусов от иммунной защиты организма.
- •33.Интерферон: виды, свойства, индукторы. Применение интерферона и его индукторов в лечении вирусных заболеваний.
- •34.Специфическая профилактика вирусных болезней животных. Типы вирусных вакцин, их достоинства, недостатки, контроль вакцинных препаратов.
- •35.Химиотерапия вирусных болезней животных. Основные группы химиотерапевтических веществ.
- •36.Общая схема лабораторной диагностики вирусных инфекций: экспресс-методы, выделение вируса из патологического материала, идентификация вируса и доказательство его этиологической роли.
- •1. Устройство вирусологической лаборатории.
- •2. Правила работы с вируссодержащим материалом.
- •3. Учет, хранение и этикетирование вирусного сырья в лаборатории
- •4. Виды патологического материала и общие принципы его отбора.
- •5. Упаковка, транспортировка, хранение и консервирование вируссодержащего материала.
- •6. Подготовка вируссодержащего материала для исследования.
- •7.Вирусоскопия как метод диагностики вирусных инфекций. Световая, электронная, иммуноэлектронная микроскопия.
- •8. Устройство и принцип работы электронного микроскопа, приготовление препаратов для электронной микроскопии.
- •9. Тельца-включения при вирусных заболеваниях: морфология, состав, расположение в клетке, диагностическое значение.
- •10.Цели использования в вирусологии лабораторных животных, их виды, требования к ним, животные-гнотобиоты, спф-животные. Латентные инфекции лабораторных животных.
- •11.Методы экспериментального заражения лабораторных животных, признаки размножения вируса в их организме, "слепые пассажи".
- •12. Порядок и основные принципы вскрытия лабораторных животных, отбор патматериала.
- •13. Цели использования в вирусологии кэ, их строение и требования, предъявляемые к ним.
- •14.Методы экспериментального заражения куриных эмбрионов.
- •15.Культивирование зараженных кэ и признаки размножения вирусов в них.
- •16.Порядок вскрытия куриных эмбрионов и отбор вируссодержащего материала.
- •17. Способы и техника культивирования эукариотических клеток вне организма (монослойный, роллерный, суспензионный, на микроносителях), преимущества и недостатки каждого метода.
- •18. Питательные среды и растворы для культивирования эукариотических клеток.
- •19.Хранение, консервирование и транспортировка кк. Проблема контаминации клеточных культур и ее решение.
- •20. Культивирование вирусов в кк: подбор культуры, заражение, культивирование зараженных культур.
- •21. Методы индикации вирусов в культуре клеток.
- •22. Получение первично-трипсинизированной культуры клеток.
- •23. Титр вируса, единицы измерения, титрование вируса в инфекционных единицах локальных повреждений.
- •24. Титр вируса, единицы измерения, титрование вируса в инфекционных единицах 50%-ного действия на чувствительные объекты.
- •25. Титр вируса, единицы измерения, титрование вируса по гемагглютинирующей активно-
- •26. Ртга (задержки): принцип реакции, компоненты, контроли, варианты постановки, учет результатов, цели применения, достоинства и недостатки.
- •27. Рнга (пассивной): принцип реакции, компоненты, контро-ли, варианты постановки, учет результатов, цели применения, достоинства и недостатки.
- •28. Рн: принцип реакции, компоненты, контроли, варианты постановки, учет результатов, цели применения, достоинства и недостатки.
- •29. Рдп: принцип реакции, компоненты, контроли, варианты постановки, учет результатов, цели применения, достоинства и недостатки.
- •30. Метод флюорохромирования, принцип метода, приготовление препаратов, диагностическая ценность. Люминесцентная микроскопия, устройство и принцип работы люминесцентного микроскопа.
- •31. Метод флюоресцирующих антител (мфа): принцип реакции, компоненты, контроли, варианты постановки, учет результатов, цели применения, достоинства и недостатки.
- •32. Иммунопероксидазная (гистохимическая) реакция: принцип, компоненты, контроли, варианты постановки, учет результатов, цели применения, достоинства и недостатки.
- •33. Твердофазный иммуноферментный анализ: принцип реакции, компоненты, контроли, варианты постановки, учет результатов, цели применения, достоинства и недостатки.
- •34. Реакция связывания комплемента: принцип реакции, компоненты, контроли, учет результатов, цели применения, достоинства и недостатки.
- •35. Метод днк-зондов: принцип метода, получение днк-зондов, постановка реакции, цели применения, достоинства и недостатки метода.
- •36. Полимеразная цепная реакция (пцр): принцип метода, компоненты, постановка реакции, цели применения, достоинства и недостатки метода.
- •Вирус бешенства.
- •2. Вирус ящура.
- •3. Вирус оспы.
- •4. Вирус болезни Ауески.
- •5. Вирусы гриппа.
- •6. Возбудители губкообразной энцефалопатии.
- •7. Вирус чумы жвачных.
- •8. Вирус ирт крс. Инфекционного ринотрахеита
- •9. Вирус парагриппа-3 крс.
- •10.Респираторно-синцитиальный вирус крс.
- •11.Возбудитель вирусной диареи крс.
- •12.Возбудитель аденовирусной инфекции крс.
- •13.Вирус лейкоза крс.
- •14.Вирус катаральной лихорадки овец.
- •15.Вирус контагиозной эктимы овец.
- •16.Вирус ачс. Африканской чумы свиней
- •17. Вирус кчс. Вирус классической чумы свиней
- •18. Вирус болезни Тешена.
- •19. Вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней.
- •20.Вирус респираторно-репродуктивного синдрома свиней.
- •21.Вирус ачл. Африканской чумы лошадей
- •22. Вирус инан. Инфекционной анемии лошадей
- •23. Вирус ньюкаслской болезни.
- •24. Вирус инфекционного ларинготрахеита птиц.
- •25.Вирус болезни Марека.
- •26.Вирус инфекционного бронхита кур.
- •27.Вирус инфекционного бурсита кур.
- •28.Аденовирусная инфекция птиц.
- •29.Вирусы лейкоза птиц.
- •30.Вирус чумы плотоядных.
- •31.Вирус алеутской болезни норок.
- •32.Вирус инфекционного гепатита собак. Болезнь рубарта
- •33.Вирус панлейкопении кошек.
- •34.Вирус инфекционного перитонита кошек.
- •35.Вирус миксоматоза кроликов.
- •36.Вирус геморрагической болезни кроликов.
29. Рдп: принцип реакции, компоненты, контроли, варианты постановки, учет результатов, цели применения, достоинства и недостатки.
РЕАКЦИЯ ДИФФУЗНОЙ ПРЕЦИПИТАЦИИ (РДП)
Принцип РДП: в слое агарового геля делают несколько лунок, в которые наливают антигены и сыворотки так, чтобы они находились соседних лунках. Из лунок антигены и сыворотки начинают диффундировать в слой геля во все стороны от каждой лунки. Если они окажутся гомологичными, то образуется комплекс антиген + антитело, который к диффузии не способен вследствие более крупных размеров. Он оседает (преципитирует) на месте образования в виде беловатой полосы преципитации (рисунок 21), которая хорошо заметна на фоне прозрачного геля. Если же диффундирующие друг другу навстречу антиген и сыворотка негомологичны, полосы преципитации не образуется.
Задачи:
обнаружение в сыворотке крови антител, гомологичных данному антигену (например, вирусу), производится при помощи схемы РДП, показанной на рисунке 22. Если в сыворотке S содержатся антитела к антигену AS, между лунками S и AS образуется полоса преципитации, отсутствующая между лунками с контрольными компонентами SN и AS;
2. обнаружение в материале антигена AS, гомологичного известным антителам сыворотки SS, производится по аналогичной схеме РДП. При наличии в исследуемом материале антигена, гомологичного антителам сыворотки SS, между А и SS должна образоваться полоса преципитации, отсутствующая между остальными лунками;
3. идентификация неизвестного вируса может быть произведена в РДП. Здесь AS неизвестный антиген; SS1...SS6 сыворотки, содержащие антитела к известным антигенам. Если полоса преципитации образовалась, например, между лунками с AS и SS3, значит, исследуемый антиген гомологичен антителам сыворотки SS3;
4. титрование антител сыворотки. Здесь высшее разведение сыворотки, еще дающее преципитацию с гомологичным антигеном (в нашем примере 1:16), служит показателем титра антител в сыворотке SS
РДП часто используют для диагностики лейкоза крупного рогатого скота (под названием реакции иммунодиффузии РИД) и ИНАН (инфекционной анемии лошадей). В обоих случаях задача сводится к обнаружению в сыворотках крови антител к соответствующим вирусам (рисунок 26).
Реакция радиальной иммунодиффузии: иммунную сыворотку с расплавленным агаровым гелем равномерно наливают на стекло. После застывания в геле делают лунки, в которые помещают антиген в различных разведениях. Антиген, диффундируя в гель, образует с антителами кольцевые зоны преципитации вокруг лунок. Диаметр кольца преципитации пропорционален концентрации антигена. Реакцию используют для определения в сыворотке крови иммуноглобулинов различных классов, компонентов системы комплемента и др.
Большое значение имеет чистота агара, лучше пользоваться очищенным агаром Дифко. Специфические антигены и сыворотки должны быть в высоких титрах, обеспечивающих образование комплекса антиген + антитело в количестве, достаточном для образования четко видимой полосы преципитации.
Постановка РДП. Обезжиренные предметные стекла укладывают горизонтально на холодную поверхность (можно на стол). Пипеткой набирают 1,5-2 мл агара, нагретого до 60 °С, и зигзагообразным движением выливают его сначала по периметру предметного стекла, а потом быстро заполняют его середину, следя за тем, чтобы не образовывались пузыри и волны. Стекла с налитым агаром (слой 1,5-2 мм), оставляют лежать 5-10 мин для затвердения агара (превращения золя в гель). В слое застывшего агара вырезают лунки. Их количество и взаимное расположение определяются целью, с которой ставят РДП, но диаметр лунок должен быть около 5 мм, а расстояние между соседними лунками 3-4 мм. Наиболее часто используют два типа расположения лунок.
Для вырезания лунок можно использовать готовый штамп (трубочки с острыми краями, жестко скрепленные в соответствии с типом расположения и количеством лунок). Если готового штампа нет, можно воспользоваться любой трубкой подходящего диаметра, например гильзой от патрона к мелкокалиберной (калибр 5,6) винтовке. В этом случае целесообразно нарисовать карандашом на бумаге количество и взаимное расположение лунок и, подложив этот трафарет под стекло с агаром, по нему вырезать лунки. Остающийся в лунках агар можно извлечь иглой, ученическим пером или пастеровской пипеткой. У образовавшихся лунок дном служит стекло, а стенками слой агара. Чтобы избежать подтекания жидкостей под агар, рекомендуют лунки заплавить, с тем, чтобы они были полностью в слое агара. Для этого пользуются разными приемами: пастеровской пипеткой в лунку вносят горячий (50-60 °С) агар и тотчас отсасывают его обратно. Соприкасаясь на короткое время с холодным дном и стенками лунки, агар успевает частично застыть и покрыть тонким слоем дно и стенки лунки. Однако если стекла хорошо обезжирены и застывший слой агара прочно сцеплен со стеклом (не «плывет» при наклоне), то и без дополнительной заливки лунок полосы преципитации образуются нормально.
В подготовленные лунки заливают компоненты РДП: антигены и сыворотки. Нужно следить, чтобы компоненты ни в коем случае не переливались через край лунок, а только заполняли объем каждой. Для этого их лучше заливать мелкими каплями с помощью тонко оттянутых пастеровских пипеток.
После заливки компонентов РДП предметные стекла помещают во влажную камеру, чтобы предотвратить высыхание агара. В качестве влажной камеры можно использовать любую закрывающуюся емкость (эксикатор, чашку Петри), в которую положены намоченные водой вата или фильтровальная бумага. Влажную камеру оставляют при комнатной температуре или ставят в термостат (в термостате диффузия идет быстрее, но незначительно).
Предварительный учет результатов рдп производят через 8-10 часов, основной через 24 и окончательный через 48 часов.
Постановка РДП в чашках Петри по технике принципиально не отличается от постановки на предметных стеклах, только тогда слой агара наливают толщиной до 3 мм, лунки делают большего диаметра и на большем расстоянии. Но в этом случае время учета отодвигается до 5-7 дней.
Методика РДП в капиллярах не нашла широкого применения в практике. Препараты РДП на предметных стеклах можно через 48-72 ч высушить и ок-
расить раствором амидного черного. Это позволяет сохранять препарат неопределенно долго и улучшает возможности фотографировать полосы преципитации.
Достоинства РДП: простота техники постановки, быстрота получения ответа, не требует стерильности, минимальная потребность в компонентах, пригодность для работы с любыми растворимыми антигенами, возможность документирования результата путем фотографирования.
Но все эти достоинства существенно умаляются ее основным недостатком низкой чувствительностью. Тем не менее, РДП достаточно широко пользуются в лабораторной диагностике вирусных болезней животных.