С.Дж.Перт

12.11.7. Забуферивание металла в культуральной среде

Константы стабильности некоторых биологически важных

комплексообразующих агентов приведены в табл. 13. Вещества, пригодные для забуферивания металлов, не должны потреб­

ляться организмом. Из органических лигандов наиболее устой­ чивы к метаболическому разрушению, вероятно, ДЦТА и ЭДТА. Полифосфаты термолабильны и стерилизовать их следует путем фильтрации. К сожалению, информация о влиянии рН на кон­ станты стабильности очень незначительна. Как можно видеть

табл. 13, в целом можно сказать следующее: наибольшее срод­ ство они имеют к Fез+, а наименьшее - к ионам кальция и маг­ ния. Степень связывания железа зависит от того, присутствует

ли оно в виде Fe 3+ или Fe 2+. Экспериментально показано, что

бактерии потребляют железо в форме ионов окиси [270]. Те ком­

плексообразующие агенты, которые образуют липофильные

комплексы, например ЭДОДА и 8-оксихинолин, могут проникать

через плазматические мембJаны организма и способствовать

поглощению ионов металла L285].

12.12. Подбор среды для культивирования

12.12.1. Минимальная среда

Количество и природа компонентов среды для культивиро­

вания определяются величиной выхода продуктов и уровнем скорости роста, которые желательно получить. Выход биомассы (экономический коэффициент) можно рассчитать, исходя из элементарного состава биомассы, а потребности в источнике

гающую 10 r бактериальной сухой биомассы на l л, если имеет­ ся избыток кислорода. В отсутствие автоматической регуляции рН значение рН во время роста культуры падает в результате потребления аммиака. Чтобы избежать внесения в среду боль­ ших количеств аммонийной соли, хорошо добавлять газообраз­ ный аммиак по сигналу рН по мере потребления ионов аммония.

Вслучае некоторых организмов вместо аммиака для поддер­

жания значения рН можно использовать мочевину или

глицин. В особых случаях может потребоваться та или иная модификация среды, например в случае использования нитрата

в качестве источника азота иногда возникает необходимость в молибдене (в виде молибдата) .. Если желательно получить в

Однако увеличение соотношения Na : К может Привести к умеиьшеиию экономического

добавлении 0,1 М фосфатного буфера рН 7,0 осмоляльность среды составляет 592 мосмолей

(теоретически), что соответствует активности воды 0,99.

2) Деиоиизироваиная вода может содержать иеидентифицированиые нейтральные opra•

нические вещества

') Потребность в калии соответствует 0,586 r КН,РО,. ') Количества серы и магния одинаковы.

5) l моль ЭДТА в расчете на l моль Mg или другосо вещелочного металла.

больших количествах какие-то продукты (не биомассу), то не­

обходимо внести в среду дополнительное количество субстрата,

из которого эти продукты образуются. Если какой-либо из ком­

понентов средь~ PI требуется сделать лимитирующим рост суб­

стратом, то его содержание следует уменьшать до тех пор, пока

концентрация биомассы будет значительно ниже максимально

возможного уровня.

Обогащение среды аминокислотами и основаниями нуклеино­ вых кислот обеспечит более экономное расходование глю1<озы,

поскольку явится источником ассимилируемого углерода и при•

ведет к увеличению скорости роста [ 134].

В культуре клеток млекопитающих добавление метаболи­

чески инертной метилцеллюлозы (О, 1%) к минимальной среде

значительно уменьшает продолжительность лаг-фазы, предше­

ствующей росту [21]; механизм этого важного эффекта не из­

вестен.

12.12.2. Стабильность среды

Главные факторы, влияющие на стабильность среды, - это природа ее компонентов; способность взаимодействовать друг

с другом; температура, особенно во время стерилизации нагре­ ванием; рН среды, кислород, свет. Целесообразно рассмотреть

влияние этих факторов на основные группы компонентов ис­ пользуемой среды.

Аминокислоты, в частности триптофан, глутамин и аспара­ гин, являются наиболее лабильными, и по этой причине их

нельзя стерилизовать нагреванием, а используют для стерили­

зации ультрафильтрование. Глутамин полностью разлагается до v-кетопирролидина при нагревании в водном растворе до 100°С и рН 7 и выдерживании при таких условиях в течение 3 ч; даже при 37 °С разложение глутамина идет с заметной ско­ ростью [113]. Цистеин в присутствии кислорода быстро превра­

щается в цистин, растворимость которого значительно ниже

(около 0,2 % при 20 °С), чем у цистеина. Однако с точки зрения

питательной ценности цистеин и цистин взаимозаменяемы.

Из водорастворимых витаминов тиамин, рибофлавин, пири­ доксин больше всего подвержены распаду. При доступе кисло­ рода и 37 °С растворенный в воде тиамии окисляется в течение недели приблизительно на 50 % и теряет биологическую актив­ ность. Он распадается при автоклавировании в течение 5 мин

при 121°С (36]. Рибофлавин разрушается в процессе автокла­ вирования при 121°С в течение 1 ч при рН 7, но при кислых значениях рН он более устойчив. Рибофлавин светочувствителен и при 32 °С может разрушиться за 1 ч на 50% под действием

комнатного рассеянного света [178], однако имеются данные и

о менее интенсивном разложении рибофлавина - на 13% за 157 ч [25]. Чувствительностью к свету обладают также фолие­

вая кислота и пиридоксин, но они теряют активность в мень­

шей степени, чем рибофлавин [25].

Сахара тоже способны до некоторой степени разлагаться при автоклавировании в присутствии неорганических солей и орга­

нических соединений, что часто сопровождается окрашиванием

в коричневатый цвет. Глюкозиды с фуранозидными группами,

например сахароза, при кислых значениях рН и при нагреве

среды и их взаимодействия. Изучение лимитации роста

различными: источниками питания в хемостатной культуре ведет

к накоплению необходимых знаний о роли каждого из элемен­

тов питания. Подобные исследования проводились главным

образом при лимитации роста некоторыми источниками углерода

и энергии и ионами аммония, калия, магния, фосфора, в то время

как роль факторов роста и микроэлементов не анализировали.

Изучение роста, лимитированного субстратом, было ограничено

главным образом несколькими бактериальными видами, и его

следует распространить на многих прокариотов и эукариотов.

Глава 13

ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ

13.1. Влияние температуры на скорость роста

Температура окружающей среды является таким фактором, влияние которого на биомассу неизбежно, поскольку темпера­ тура клетки должна стать такой же, как и температура куль­

туральной среды. В отличие от этого значение рН или актив­

ность воды в клетке не обязательно должны уравниваться со

значениями их во внешней среде. Температура влияет на ско­

рость клеточных реакций, природу метаболизма, пищевые по­ требности и состав биомассы.

Влияние температуры на скорость роста показано на рис. 48.

В широком диапазоне температур, .лежащих ниже оптимума,

температурный коэффициент скорости роста соответствует Qш, равному приблизительно 2, т. е. при повышении температуры на 10°С скорость роста увеличивается вдвое. При температуре на 10-25 °С ниже оптимальной скорость роста приближается к

нулю. Влияние температуры на длительность лаг-периода па­

раллельно действию на скорость роста (разд. 19.5).

13.2. Энергия активации роста

Скорость химических реакций связана с температурой урав­ нением Аррениуса

(13.1)

где К - скорость реакции, R - газовая постоянная, Т - абсо­ лютная температура, А - константа, зависящая от частоты об­

разования активированных комплексов реагирующих соедине­

ний, Е - константа, известная как «энергия активации» или

«температурная характеристика».

Из уравнения (13.1) мы имеем

клеток мышей подобен соответствующему графику для бакте­ рий, с той лишь разницей, что значение Е постоянно лишь на участке от 37 до 30 °С, а при температуре ниже 30 °С значение

Е возрастает (341].

Необходимо отметить, что температурный коэффициент ско­ рости роста, выраженный как Q10, является функцией темпера­ турного диапазона, поскольку из уравнения Аррениуса следует:

нормальных для роста температурах этот эффект будет выра­

жен слабо. Значение энергии активации - очень ценный пока­

затель, поскольку дает возможность предсказать влияние тем­

пературы на скорость роста в широком диапазоне температур.

Изменения в энергии активации указывают, что могут про­

исходить изменения в реакциях, контролирующих скорость

роста, или метаболической регуляции. В пользу этой точки зре­ ния свидетельствуют данные, показавшие, что у Е. coli репрес­

сия В-rалактозидазы под влиянием глюкозы ослабевает при

температуре ниже 25°С, а при 10°С снимается совсем [224].

Температурный диапазон роста отдельных видов бактерий

13.3. Верхние экстремальные температуры роста

Уменьшение скорости роста при верхних экстремальных

температурах может быть следствием как нарушения метаболи­ ческой регуляции, так и отмирания клеток. В случае отмирания клеток скорость роста жизнеспособной биомассы (х) выражает­

рания. При высоких температурах скорость отмирания клеток

будет превышать скорость роста, если энергия активации отми­

рания превысит энергию активации роста. В частности, это было

обнаружено в случае Klebsiella aerogenes, у которой энергия

активации отмирания составляла 32 900 кал, а энергия актива­ ции роста равнялась 14 230 кал [323].

Повышение температуры в конечном итоге приводит к раз­

рушению структуры белка, что в свою очередь оказывает влия-