2.2.3. Количественное определение содержания рутина методом титрования

Для определения рутина (витамина Р) берется навеска корма 0,50г и тщательно растирается в ступке, переносится в колбу, заливается 50мл горячей дистиллированной воды и проводится экстракция в течение 5 минут. Затем отфильтровывается 10 мл раствора, переносится в коническую колбу. К нему добавляется 10мл дистиллированной воды и 10 капель индигокармина. Титруется 0,05 н. раствором перманганата калия до получения устойчивой желтой окраски.

Определяется процентное содержание рутина в корме. Расчет проводится по формуле (4):

(4)

где

Х – содержание Витамина Р (мг%);

А – количество 0,05 н раствора KMnO4, мл ;

m – количество сухого вещества, взятого для анализа, г;

10 – количество вытяжки, взятое для титрования;

50 – количество воды, добавленное к сухому веществу для экстракции (общее количество вытяжки);

100 – общее количество вещества в г для расчета процентного содержания (1000мкг переводим в мг ).

2.2.4. Спектрофотометрическое определение суммы антоциановых пигментов

Антоцианы имеют максимум абсорбции в области 510-550 нм. Высокая экстинкция (2•10⁴, 4•10⁴) антоцианов при максимуме абсорбции в видимой области в водных растворах с низким значением pH и в спиртах, подкисленных соляной кислотой, позволяет применять абсорбцию антоцианов для их количественного определения. В случае особенно лабильных антоцианов соляную кислоту заменяют на уксусную или щавелевую.

Ход анализа. Берется навеска массой 2,0-1 г. Растирается в фарфоровой ступке со стеклянным или кварцевым песком и 10 мл 1%-ного раствора соляной кислоты. Далее гомогенат центрифугируют в течение 30-45 минут при 4500 об/мин. Содержание суммы антоцианов рассчитывают по формуле с применением удельного показателя поглощения цианидин-3,5-дигликозида в 1%-ном водном растворе соляной кислоты (453). Поглощение данных пигментов определяют на спектрофотометре при длине волны 510 нм. Для внесения поправки на содержание зеленых пигментов П.В. Масленниковым предложено определять оптическую плотность полученных экстрактов при 657 нм.

Расчеты производятся по формуле (5)

(5)

где

Х – концентрация суммы антоцианов (%);

D₅₁₀ – оптическая плотность раствора при длине волны 510 нм;

D₆₅₇ – оптическая плотность раствора при длине волны 657 нм;

V – объем экстракта;

E – удельный показатель поглощения цианидин-3,5-дигликозида при длине волны 510 нм в 1%-ном водном растворе соляной кислоты, равный 453;

А – масса сырья.

2.2.5. Определение массовой концентрации водорастворимых антиоксидантов на приборе «ЦветЯуза-01-аа»

Определение суммарного содержания антиоксидантов в корме проводилось на приборе «ЦветЯуза-01-АА» с амперометрическим детектированием (АД). Амперометрическое детектирование заключается в измерении электрического тока в ячейке, возникающего при окислении анализируемого вещества на поверхности рабочего электрода при подаче на него определенного потенциала. Таким образом, при применении АД регистрируется изменение тока, протекающего через ячейку, обусловленное изменением концентрации анализируемого вещества. В качестве материала рабочего электрода используется стеклоуглерод. Прибор работает следующим образом: насос постоянно прокачивает элюент, забирая его из емкости через всю систему. В кран-дозатор в положении «ввод» стандартным медицинским шприцем вместимостью 1 см³ в дозируемую петлю вводится исследуемый раствор. Поворотом ручки крана в положение «анализ» поток элюента направляет определенную дозу исследуемого вещества, заключенную в петле, в ячейку детектора. В этой ячейке на поверхности рабочего электрода происходит окисление молекул исследуемого вещества, при этом возрастает электрический ток между двумя электродами.

Способность к захвату свободных радикалов флавоноидами или другими полифенолами может измеряться величиной окисляемости этих соединений на рабочем электроде амперометрического детектора. Сигнал регистрируется в виде дифференциальных выходных кривых. С помощью специального программного обеспечения производится расчет площадей или высот пиков (дифференциальных кривых) анализируемого и стандартного веществ. Для анализа используется среднее значение из 3 последовательных измерений. В качестве стандартного вещества (элюента) применялся антиоксидант кверцетин.

Амперометрический метод – единственный непосредственно измеряющий содержание всех антиоксидантов в пробе.

Для подготовки анализируемого вещества были взяты пробы трех образцов кормов массой 0,2 г. в трех повторностях. Полученные навески переместили в колбы и залили горячей бидистиллированной водой объемом 50 мл., затем их настаивали в течение часа, периодически помешивая, и, по истечении времени, отфильтровали, получив необходимую для дальнейшей работы экстракцию.

Перед началом работы необходимо построить градуировочный график кверцетина. Для этого последовательно измеряют сигналы стандартных градуировочных растворов кверцетина с массовой концентрацией 0,2; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0 мкг/мл.

Полученные данные для построения графика кварцетина представлены в таблице №1.

Таблица 1

Значения сигналов стандартных градуировочных растворов кверцетина с массовой концентрацией 0,2; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0 мкг/мл.

Концентрация кверцетина; мкг/мл	Повторность			Среднее значение сигнала
	1	2	3
0,2	138	134	128	133
0,5	243	228	232	234
1	470	475	458	468
2	919	933	924	925
4	1927	1930	1956	1938

Настоящая методика обеспечивает выполнение измерений содержания антиоксидантов исследуемого образца с погрешностью, не превышающей 5% во всем диапазоне измеряемых величин при доверительной вероятности 0,95.

Рис. 1. Градуировочный график кверцетина

При помощи полученного уравнения (6), вычисляется значение массовой концентрации антиоксидантов в исследуемых образцах комбикорма. Для этого измеряются сигналы исследуемого раствора для каждой пробы в трех повторностях и для каждого рассчитываются их среднее арифметическое, которое подставляется в уравнение (6) вместо «y».

Из линейного уравнения с одной неизвестной определяется значение «Х», которое соответствует значению массовой концентрации антиоксидантов исследуемого образца, найденному по градуировочному графику кварцетина, мг/г.

После того, как значение X стало известным, остается вычислить непосредственно само содержание антиоксидантов в исследуемом комбикорме по формуле (7).

(7)

где

Х` – содержание антиоксидантов, мг/г;

Х - значение массовой концентрации антиоксидантов исследуемого образца, найденное по градуировочному графику кварцетина, мг/г;

V – объем раствора анализируемой пробы, мл;

m – масса навески корма, г;

N – кратность разбавления анализируемого образца.