диссертации / 26

21

недель. Предполагают, что в организме человека существует гомеостатический механизм регуляции числа Т-лимфоцитов на периферии, построенный по принципу обратной связи [11]. Однако данный механизм поддержания пула Т-

лимфоцитов при беременности не исследовался.

Несмотря на то, что важная роль тимуса как центрального органа иммунной системы и Т-клеточной дифференцировки, установлена уже давно, до недавнего времени изучение функции тимуса было затруднено из-за отсутствия прямых методов исследования. В настоящее время для изучения функциональной активности тимуса применяют метод определения в лимфоцитах колец реаранжировки генов α-цепи антигенраспознающего рецептора или TREC (T-cell receptor rearrangement excision circles). Измерение количества TREC методом полимеразной цепной реакции позволяет выявить клетки, недавно вышедшие из тимуса, и, таким образом, оценить его функциональную активность тимуса [65, 186]. Считается, что содержание TREC можно оценивать преимущественно как показатель Т-лимфопоэтической функции тимуса [39].

TREC формируется при перестройке генов Т-клеточного рецептора в тимоцитах, при этом образуется последовательность нехромосомной кольцевой ДНК, которая присутствует только в наивных Т-лимфоцитах и в последующем не реплицируется при их митозе и в процессе деления клетки переходит лишь к одной из дочерних клеток [65, 186]. В случае внетимусного созревания Т-

лимфоцитов, TREC в клетках не определяется [65].

Наиболее высокое содержание TREC характерно для недавних эмигрантов из тимуса [6]. Напротив, Т-клетки памяти, участвовавшие в иммунном ответе, т.е.

ранее отвечавшие пролиферацией на действие антигена, практически лишены

TREC [6]. Следовательно, уровень TREC в Т-лимфоцитах периферической крови показывает интенсивность двух процессов – эмиграции Т-клеток из тимуса (чем она выше, тем больше TREC определяется в Т-клетках) и уровня пролиферации в периферическом отделе иммунной системы (она снижает содержание TREC в Т-

клетках) [6].

22

В литературе представлены работы о снижении уровня TREC при различных патологических состояниях, таких, как первичный Т-клеточный иммунодефицит, вариабельный неклассифицируемый иммунодефицит, кожная Т-

клеточная лимфома, ревматоидный артрит, рассеянный склероз [160, 54, 78, 188, 104]. При ВИЧ-инфекции на ранней стадии наблюдается увеличение количества

TREC в CD4+ Т-клетках, что обусловлено как увеличением гибели зрелых CD4+

Т-клеток, так и большей по сравнению со здоровыми донорами эмиграцией клеток из тимуса [75]. На поздней стадии ВИЧ-инфекции уровень TREC

снижается, что может быть связано со снижением тимопоэза вследствие дефектов костномозговых предшественников лимфоидной линии [189], однако после успешного завершения противовирусной терапии оно способно восстановливаться до нормальных значений [190, 89]. Также имеются данные о снижении уровня TREC в периферической крови под влиянием сублингвальной и подкожной аллерген-специфической терапии больных с аллергией к клещам

Dermatophagoides pteronyssinus [185]. Кроме того, определение экспрессии ДНК

TREC используется для оценки интенсивности тимопоэза в поддержании Т-

клеточной популяции на периферии после аллогенной трансплантации костного мозга или стволовых кроветворных клеток [51].

Показано, что как у детей, так и у взрослых, количество TREC достигает границы нормы примерно спустя 6 месяцев после трансплантации [156, 199]. При полном удалении тимуса наблюдается обратная ситуация. Так по данным литературы, TREC могут определяться в крови до десяти лет после перенесенной тимэктомии [53, 198]. Это совпадает с данными, полученными на обезьянах, в

течение года после перенесенной операции количество TREC снижалось примерно на один порядок [112]. Предполагают, что признаки активности тимуса после полного удаления этого органа могут быть обусловлены функционированием дополнительной тимусной ткани – так называемого

«шейного тимуса» - эктопической ткани тимуса в шейном отделе позвоночника

[170].

23

Однако при различных физиологических состояниях характер экспрессии

TREC остается мало изученным. Известно, что с возрастом происходит инволюция тимуса и уменьшается количество островков, где происходит процесс тимопоэза [210, 43, 84]. Это, в свою очередь, сказывается на количестве наивных Т-клеток, выходящих из тимуса и соответственно на концентрации TREC, которая уменьшается с возрастом, что свидетельствует о снижении функциональной активности тимуса [65, 140, 8]. Особенно быстрое снижение уровня TREC

регистрируется впервые 10 лет жизни человека, далее этот процесс замедляется,

но неуклонно прогрессирует в каждом последующем десятилетии [6].

Это позволяет предположить, что и при беременности, которая сопровождается транзиторной атрофией тимуса, должен изменяться уровень экспрессии TREC периферическими лимфоцитами. Однако данных об изменении количества TREC при беременности крайне малочисленны. В литературе имеется лишь одна работа о снижении уровня TREC у беременных женщин во 2 триместре гестации относительно показателей у небеременных женщин [100].

Кроме того, в настоящее время наряду с исследованием уровня экспрессии

TREC лимфоцитами, в качестве маркера функционирования тимуса предлагается рассматривать молекулу CD31 [129]. Молекула CD31, известная также как

PECAM-1, относится к адгезионным молекулам межклеточного взаимодействия семейства Ig-подобных белков и представляет собой одноцепочечную молекулу,

содержащую 6 Ig-подобных внеклеточных доменов, короткий трансмембранный сегмент и хвост, погруженный в цитоплазму [34]. Предпологается, что CD31

функционирует как молекула клеточной адгезии за счет наличия Ig-подобных доменов и их высокой плотности в эндотелиальных межклеточных пространствах

[34]. Экспериментальные исследования выявили, что моноклональные антитела,

специфичные к CD31, блокируют миграцию моноцитов и нейтрофилов [150].

Однако, в противоположность этому, исследования in vitro [181] и in vivo [44]

показали, что наличие экспрессии CD31 на лимфоцитах отрицательно коррелирует с их миграцией.

24

CD31 экспрессируется на поверхности наивных Т-лимфоцитов, недавних выходцев из тимуса, а внетимическое созревание наивных Т-лимфоцитов совпадает с прогрессирующим уменьшением экспрессии CD31 [202]. Дальнейшие исследования ряда авторов показали, что у взрослых людей периферические Т-

клетки в основном не экспрессируют CD31, причем это относится, главным образом, к клеткам памяти [64]. Более того, утрата молекулы CD31 наблюдалась при активации и дифференцировке Т-лимфоцитов [60], особенно этим отличались

CD4+ T-клетки [154]. Однако, механизм, лежащий в основе потере CD31 с

поверхности T-клеток, в настоящее время не известен. Доказательством того, что молекулу CD31 возможно использовать в качестве прямого маркера для характеристики активности тимуса человека, является то, что после аутологичной трансплантации стволовых клеток практически все вновь появившиеся наивные

CD4+ Т-клетки экспрессировали на своей поверхности CD31 [83]. Известно, что у человека доля CD31-позитивных CD4+ и CD8+ лимфоцитов коррелирует с объемом тимуса, уровнем TREC и снижается с возрастом [61]. На основании всех этих данных в настоящее время предлагается выделять CD31+ thymic и CD31- central

наивные Т-лимфоциты [121], что позволяет идентифицировать наивные клетки тимического происхождения. Однако данные об особенностях содержания CD31+ thymic и CD31- central наивных Т-лимфоцитов при беременности отсутствуют.

Достаточная продолжительность непосредственного контакта материнских лимфоцитов с разнообразными антигенами плода во время гестационного процесса позволяет предположить возможность формирования

«иммунологической памяти», сопровождающейся изменением процесса дифференцировки лимфоцитов и формированием особых пулов клеток-памяти

[18, 27, 66, 92, 113, 183, 184, 149, 167]. Развитие иммунологической памяти,

которая формируется в ходе иммунного ответа на антиген, представляет очень важный феномен, поскольку способность формировать клетки памяти обеспечивает одно из наиболее кардинальных отличий адаптивного иммунитета от врожденного иммунитета [39]. Кроме того, формирование клеток памяти обеспечивает вторичный иммунный ответ, который является более быстрым,

25

мощным и результативным, чем первичный ответ [123, 124, 135, 179, 201].

Фактически клетки памяти обеспечивают собственно наличие иммунитета к конкретному антигену.

Феномен иммунологической памяти является одной из самых изучаемых проблем фундаментальной иммунологии в последнее десятилетие. Однако основные исследования этого вопроса проводились в области инфекционной иммунологии [40, 82, 105, 109, 123, 124, 174], онкологии [86, 128] и при аутоиммунной патологии, в частности при ревматоидном артрите [77].

Исследования последних лет существенно поменяли наше представление о процессе дифференцировки Т-лимфоцитов. Клетки памяти образуются в ходе иммунного ответа, и проходят ряд определенных стадий, характеризующихся своими особенностями [123, 124, 135, 179, 201]. В настоящий момент предложены различные модели формирования Т-клеток памяти, по-разному трактующие этапность их дифференцировки [129, 130, 135, 136, 137]. Линейный путь дифференцировки клеток памяти долгое время являлся наиболее популярной моделью, предполагающей последовательное развитие клеток памяти по схеме:

наивные клетки → коротко живущие эффекторные клетки → клетки памяти [192].

При этом предполагается, что развитие клеток памяти происходит либо после удаления АГ, либо при значительном снижении его концентрации [135].

Вариантом линейной модели является гипотеза снижения эффекторного потенциала [123, 179], предполагающая, что эффекторные клетки утрачивают свои функциональные свойства и быстро уходят в апоптоз после длительной антигенной стимуляции, при этом количество Т-клеток памяти уменьшается

[123]. Однако спустя некоторое время после элиминации антигена эффекторные клетки могут переходить в клетки памяти и восстанавливать свою функцию [123, 179]. В более поздних работах рассматривается возможность параллельного формирования пула коротко живущих эффекторных клеток и клеток памяти из наивных клеток, или формирования клеток памяти и из пула эффекторных клеток и непосредственно из наивных лимфоцитов после антигенной стимуляции

[196,119,122].

26

По литературным данным, процесс формирования клеток памяти запускается в течение 3-5 дней после контакта с антигеном [73, 109, 157, 171].

После взаимодействия со специфическим антигеном наивные лимфоциты дифференцируются в короткоживущие эффекторные клетки и клетки памяти [47, 192]. Многие исследователи считают, что переход клеток на различные этапы дифференцировки ассоциируется с изменением экспрессии изоформ молекул

CD45 и наличием молекул L-селектина (CD62L) [95, 171]. Формирующиеся пулы клеток памяти, имеют отличный от наивных клеток фенотип, и характеризуются различной экспрессией молекул CD44, CD45RA, CD45RO, CD62L, СD27, CD28, CD11b, CD11a, CD49d, FasL, хемокиновых рецепторов и продукцией ряда цитокинов [47, 192, 95, 77, 171, 201, 204]. Благодаря этим молекулам определяются путь миграции лимфоцитов во вторичные лимфоидные органы или в ткани, проявление их функциональных свойств и устойчивость к апоптозу [47, 131].

В соответствии с экспрессией изоформ CD45 молекул, наличием CD62L и CCR7 молекул принято выделять пулы наивных клеток (Tn), центральных клеток памяти (Tcm), претерминально-дифференцированных эффекторных клеток памяти (Tem) и терминально-дифференцированных клеток памяти (Temra),

различающиеся фенотипически и обладающие различными эффекторными функциями [47, 171, 95, 204].

Пул наивных клеток имеет фенотип CD45RA+CD45RО-CD62L+CCR7+ CD27+CD28+ [101]. Эти лимфоциты не примированы в отношении конкретного антигена и не обладают способностью к выполнению эффекторной функции [39].

У человека наивные клетки несут на своей поверхности молекулы CD62L (L-

селектин) и CCR7, что позволяет им мигрировать преимущественно во вторичные лимфоидные органы, такие как лимфатические узлы, пейеровы бляшки и селезенку [131]. Эти органы представляют места, где дендритные клетки,

нагруженные АГ, представляют комплекс АГ-МНС наивным Т-клеткам и обеспечивают соответствующие ко-стимуляторные сигналы для инициации иммунного ответа, при этом важная костимулирующая роль принадлежит

27

молекуле CD28, через которую в Т-лимфоцит проходит дополнительный импульс,

приводящий к усилению синтеза IL-2, активации генов выживания и запуску пролиферации Т-клетки [131]. Наивные Т-лимфоциты, циркулируя на периферии и не контактируя с чужеродными антигенами, могут существовать многие месяцы, и даже годы [39, 101]. Данные о содержании наивных клеток в различных популяциях периферических Т-лимфоцитов неоднозначны. Так, у взрослых доноров уровень наивных клеток в популяции периферических CD4+ лимфоцитов колебался в пределах 30-50% [145], в популяции периферических CD8+

цитотоксических лимфоцитов – 12,9-36,3% [80], в популяции Treg – 20-50% [67].

Известно, что антигенная стимуляция запускает сложный многоступенчатый процесс дифференцировки клеток адаптивного иммунного ответа [95]. После контакта со специфическим антигеном наивные лимфоциты дифференцируются в эффекторные клетки, а часть из них приобретают свойства клеток памяти [95, 213, 39]. При этом наивные Т-клетки переключаются на синтез низкомолекулярной изоформы молекулы CD45RO. Как показали исследования

Hamann D. с соавторами (1996 год), переключение фенотипа CD45RA+ на

CD45RO+ проходит через стадию двойных позитивных CD45RA+CD45RO+

клеток [101]. Биологический смысл изменений структуры молекулы CD45 неясен.

Предполагают, что формирование иммунного синапса с участием клеток,

несущих укороченный вариант молекулы CD45, облегчается благодаря устранению помех для взаимодействия клеток, создаваемых протяженной молекулой CD45RA [39]. Помимо этого показано, что CD45RA+ Т-клетки при действии активирующих сигналов более подвержены апоптозу [39]. Т-клетки памяти дифференцируются из активированных Т-лимфоцитов (CD4+ и CD8+) в

Т-зонах лимфоидных органов под действием антигена, презентируемого им дендритными клетками [39]. Развитие CD8+ Т-клеток памяти нуждается в помощи CD4+ Т-клеток [39].

Принято считать, что после контакта с антигеном формируются центральные клетки памяти, имеющие фенотип CD45RACD45RO+CD62L+CCR7+CD28+CD11a+/CD18+CD11b+/CD18+CD49d+, которые

28

в этом своем состоянии не проявляют эффекторные функции, но могут быстро отвечать на антиген при повторной стимуляции [95, 192, 184, 77, 86]. Благодаря экспрессии на своей поверхности CD62L и CCR7, Tcm также как и Tn

преимущественно мигрируют во вторичные лимфоидные органы и костный мозг кроме того, осуществляют миграцию через активированный эндотелий в ткани

[131, 204]. Установлено, что центральные клетки памяти имеют гипо-

ацетилированные гены цитокинов и не имеют или имеют низкую эффекторную функцию, но эффективно дифференцируются в Th1 или Th2 эффекторные клетки после стимуляции TCR в присутствии IL-12 или IL-4 [141, 201, 171].

Цитотоксические Т-лимфоциты на этой стадии дифференцировки после стимуляции продуцируют в больших количествах IFNγ, TNFα, перфорин и гранзимы [95]. Центральные клетки памяти в популяции Т-хелперов продуцируют комплекс цитокинов, характерных либо для Th1 типа, либо для Th2 типа иммунного ответа или иных субпопуляций Т-хелперов [77, 101]. Однако в настоящее время показано, что Т-хелперы обладают свойством пластичности,

заключающееся в том, что под воздействием ряда факторов окружающей среды при повторной стимуляции специфическим антигеном центральные CD4+ клетки памяти сохраняют способность реагировать на сигналы окружающей среды и ситуационно экспрессировать соответствующие, атипичные гены цитокинов

противоположных линий [130].

При вторичном иммунном ответе, Tcm клетки генерируют новые волны эффекторных клеток в антиген-дренирующих лимфатических узлах [132, 171]. По

завершению иммунного ответа часть пула Tcm гибнет, уходя в апоптоз, т.к. эти клетки не отличаются высоким уровнем экспрессии CD95L молекул [215].

Помимо этого, центральные клетки памяти обладают высоким пролиферативным потенциалом и способностью к самообновлению [39, 213], что позволяет части из них продолжать циркулировать в периферической крови, обеспечивая проявление феномена иммунологической памяти на системном уровне [97, 134].

Другая фракция клеток памяти получила название эффекторных клеток памяти. Эти лимфоциты проходят в своем развитии через стадии

29

претерминально-дифференцированных эффекторных клеток памяти (Tem) с

фенотипом CD45RA-CD45RO+CD62L-CCR7-СD28+/- и терминально-

дифференцированных клеток памяти (Temra), имеющих фенотип

CD45RA+CD45RO-CD62L-CCR7-CD28-CD11a+CD11b+CD49d+FasL+ [192, 95, 77, 86, 171, 201]. Тem и Temra лимфоциты появляются на 5 день после антигенной стимуляции, локализуются преимущественно в нелимфоидных органах и в слизистых [30, 131, 174].

В отличие от Tcm, претерминально-дифференцированные и терминально-

дифференцированные клетки памяти не экспрессируют на своей поверхности

CD62L и CCR7, что обуславливает значительное ослабление их способности эффективно рециркулировать через лимфатические узлы и пейеровы бляшки,

мигрировать в Т-зоны вторичных лимфоидных органов [131, 87]. Вместо этого,

оба этих клеточных типа мигрируют в периферические и нелимфоидные ткани,

где они могут обеспечивать эффективную цитотоксическую активность [131].

Большинство Tem и Temra проявляют значительную миграционную избирательность для определенных тканей, таких как кишечник или кожа, в

зависимости от набора рецепторов и места поступления антигена [165]. Считают,

что эти субпопуляции являются единственными клеточными типами,

демонстрирующими тропизм к периферическим тканям, зависящий от происхождения презентируемого АГ [85, 142]. Все это обеспечивает быстрое развитие вторичного иммунного ответа эффекторными клетками памяти в периферических тканях [132, 171]. Пул Тem клеток в естественных условиях имеет поляризованные ацетилированные паттерны генов цитокинов и быстро производят большие количества цитокинов и ряда функциональных молекул при антигенной стимуляции [86, 77, 141].

На стадии Temra лимфоциты устойчивы к апоптозу и являются наиболее мощными потенциальными продуцентами цитокинов при повторном контакте с антигеном [97, 134, 192]. Кроме того, благодаря высокому уровню экспрессии

CD95L молекул пул терминально-дифференцированных клеток представляют наиболее длительно живущие клетки-памяти, которые могут циркулировать в

30

кровотоке на протяжении всей жизни человека [95, 205]. Как и все клетки памяти

Temra клетки способны к пролиферации при непосредственном контакте с антигеном без этапа его представления дендритными клетками и макрофагами

[158].

Показано, что аллогенная стимуляция in vitro приводит к изменению дифференцировки как CD4+, так и CD8+ лимфоцитов аналогично изменениям при противовирусном ответе [82].

Однако характер дифференцировки Т-хелперов и цитотоксических Т-

лимфоцитов в динамике неосложненной беременности остается не изученным.

Ранее исследования содержания наивных клеток и клеток памяти в периферической крови и плаценте у беременных женщин с гипертензивными расстройствами проводились по экспрессии CD45RA+ и CD45RO+ молекул.

Имеются лишь единичные данные об общем содержании цитотоксических Т-

лимфоцитов и Т-хелперов в крови и в плаценте при неосложненном течении беременности [9]. Ряд авторов утверждают, что для неосложненной беременности в 3 триместре гестации характерно преобладание в периферической крови

CD4+CD45RA+, тогда как для гестоза характерно увеличение содержания

CD4+CD45RO+ [111]. По данным Сотниковой Н.Ю. с соавт. при гестозе в периферической крови женщины уровень CD45RO+ клеток снижался [9]. В

некоторых работах было установлено увеличение относительного содержания периферических 45RO+ лимфоцитов в популяции Т-хелперов при преэклампсии

[45, 139].

В дальнейших исследованиях дифференцировка лимфоцитов с образованием клеток памяти в популяциях CD4+ и CD8+ лимфоцитов изучались более подробно. В настоящее время, большинство работ по изучению характера дифференцировки Т-лимфоцитов посвящены гипертензивным расстройствам во время беременности [4, 24, 17]. Так, в работе Гасановой Д.Д. (2012) в

периферической крови беременных женщин с гипертензивными расстройствами в популяции Т-хелперов отмечалось увеличение доли терминально-

дифференцированных клеток памяти с фенотипом CD45RA+CD62L- [7], которые