диссертации / 26

81

течением гестационного процесса и развившимся впоследствии самопроизвольным выкидышем в 1 триместре гестации. Несмотря на то, что некоторые исследователи отмечали снижение сывороточного уровня IL-2 при угрозе прерывания беременности в 1 триместре гестации [22], результаты наших исследований полностью совпадают с данными тех авторов, которые показали увеличение содержания IL-2 в сыворотке крови при угрозе прерывания беременности по сравнению с группой женщин с неосложненным течением беременности [13]. Следовательно, выявленный нами рост уровня наивных клеток в популяции Т-хелперов у женщин с развившимся впоследствии самопроизвольным выкидышем вполне мог быть обусловлен стимулирующим влиянием IL-2.

Известно, что для беременности характерно явление микрохимеризма,

характеризующееся наличием в организме генетически отличающихся клеток, на которые не происходит развитие иммунного ответа при низком уровне антигенной нагрузки [147, 46, 58, 203, 55, 211, 138]. Микрохимеризм представляет собой явление, характеризующееся присутствием в многоклеточном организме небольшого количества клеток, которые происходят и самостоятельно передаются в обход полового размножения от другого родственного многоклеточного организма и, следовательно, генетически отличны от клеток хозяина-носителя

[145, 46, 58]. Ряд авторов предполагают, что трансплацентарная миграция плодовых клеток естественна для нормального развития плаценты и плода, и их циркуляция во время беременности осуществляет важную роль в индукции иммунологической анергии и/или толерантности у матери и плода [93]. При повышении порогового уровня - более 1% от всех клеток организма, идет пролиферация специфических клонов наивных лимфоцитов. Так, в работах некоторых авторов было показано, что при развитии различной акушерско-

гинекологической патологии, в организме матери отмечается увеличение клеток микрохимер плодового происхождения [166, 195, 138], что связывают с ростом проницаемости плацентарного барьера [9, 184]. Можно предположить, что выявленное нами повышение уровня наивных Т-лимфоцитов в популяции Т-

82

хелперов при развитии самопроизвольного выкидыша определяется, в том числе и этим механизмом.

При проведении ретроспективного анализа содержания наивных клеток с фенотипом CD45RA+CD62L+ беременных женщин (5-8 недель гестации) в

популяции Т-хелперов периферической крови было установлено, что высокие значения показателя Tn клеток (равное или более 46,7%), позволяют с высокой точностью прогнозировать развитие раннего самопроизвольного выкидыша.

Точность способа составляет 85,1%, чувствительность 76,9%, специфичность

88,9%. Установленный нами прогностический параметр может быть рекомендован для внедрения в практическое здравоохранение, что дает возможность своевременно выбрать правильную тактику ведения женщин с риском развития данной акушерско-гинекологической патологии и избежать неблагоприятных исходов беременности. На основании полученных данных нами была оформлена заявка на изобретение «Способ прогнозирования самопроизвольного выкидыша» (положительное решение о выдаче патента от 14

мая 2014 г.)

Наивные Т-лимфоциты (CD4+ и CD8+) в Т-зонах лимфоидных органов под действием антигена, презентируемого им дендритными клетками, подвергаются клональной экспансии и дифференцируются в короткоживущие эффекторные клетки, при этом часть из них приобретают свойства клеток памяти [171, 95, 184].

Развитие иммунологической памяти, которая формируется в результате иммунного ответа на антиген, представляет очень важный феномен, так как способность формировать клетки памяти обеспечивает одно из наиболее кардинальных отличий адаптивного иммунитета от врожденного [39].

Исследование особенностей дифференцировки Т-лимфоцитов при беременности представляет несомненный интерес, поскольку во время гестационного процесса возможен непосредственный контакт материнских иммунных клеток с фетальными антигенами [184]. Это может вызывать формирование пулов клеток-

памяти, влиять на экстратимическую дифференцировку лимфоцитов, определять особый характер продукции цитокинов.

83

Исследования последних лет показали, что уровень функциональной активности Т-лимфоцитов определяется стадией их дифференцировки, при этом различают 3 пула клеток памяти, характеризующихся различной экспрессией молекул CD45RA, CD45RO, CD62L, CCR7, СD27, CD28, CD11b, CD11a, CD49d, FasL, продукцией ряда цитокинов и функциональных молекул [184, 171, 95, 77].

Вопрос о линейности дифференцировки Т-лимфоцитов до конца не изучен. В

настоящее время предлагается несколько вариантов дифференцировки Т-

лимфоцитов [123, 124, 135, 179, 201]. Однако предполагают, что изменение экспрессии изоформ молекул CD45 непосредственно ассоциировано с переходом клеток на различные этапы дифференцировки [171, 95, 184, 77].

Результаты многочисленных исследований последних лет показывают, что во время беременности в периферический кровоток матери поступают как фрагменты синцитиотрофобласта, ворсин хориона и ДНК плода, так в значительном количестве и его лимфоциты [18, 27, 66, 92, 113, 183, 184, 149, 167].

Такая ситуация, казалось бы, должна сопровождаться патологическим ответом со стороны иммунной системы матери, но в норме этого не происходит, и только при осложнениях гестационного процесса (невынашивании беременности,

преэклампсии, фето-плацентарной недостаточности и др.) многие исследователи отмечают развитие цитотоксических и аутоиммунных реакций [166, 195]. При патологии беременности, в частности при преэклампсии и досрочном прерывании беременности количество клеток плодового происхождения в организме матери значительно возрастает [166, 195, 138], что, вероятно, может способствовать развитию цитотоксических и аутоиммунных реакций, направленных на отторжение плода [176, 102].

Как предполагают различные исследователи, повышение уровня антигенного материала плодового происхождения в периферическом кровотоке беременной женщины при патологии беременности происходит в результате нарушения плацентарных барьеров [9, 184]. То есть неадекватный ответ материнской иммунной системы играет важную роль в развитии привычного

84

невынашивания, идиопатического бесплодия и самопроизвольного выкидыша,

преэклампсии [41, 9, 133, 163].

Следовательно, стимуляция иммунной системы матери антигенами плода является необходимым фактором нормального развития беременности [9], а

избыточное поступление антигенов при нарушении барьерной функции плаценты приводит к формированию патологии беременности [167, 152].

Достаточная продолжительность непосредственного контакта материнских лимфоцитов с разнообразными антигенами плодового происхождения во время гестационного процесса позволяет предположить возможность формирования

«иммунологической памяти», сопровождающейся изменением процесса дифференцировки материнских Т-лимфоцитов и формированием особых пулов клеток памяти [18, 27, 66, 92, 113, 183, 184, 149, 167].

Однако проведенное нами исследование не выявило увеличения пропорции различных пулов клеток памяти в популяциях Т-хелперов и цитотоксических Т-

лимфоцитов периферической крови беременных женщин на всем протяжении гестационного процесса при сравнении с небеременными донорами. Более того,

наступление неосложненной беременности уже в 1 триместре гестации сопровождалось достоверным снижением уровня претерминально-

дифференцированных клеток в популяции CD8+ лимфоцитов по сравнению с показателями небеременных женщин, сохранявшееся и во 2 триместре беременности, с постепенным увеличением до показателей небеременных женщин к 3 триместру гестации. По литературным данным известно, что Тem

клетки в естественных условиях имеют поляризованные ацетилированные паттерны генов цитокинов и быстро производят большие количества цитокинов и ряда функциональных молекул при антигенной стимуляции [86, 77, 141, 87].

Претерминально-дифференцированные клетки памяти не экспрессируют на своей поверхности CD62L и CCR7 молекулы, что обуславливает значительное ослабление их способности мигрировать в Т-зоны вторичных лимфоидных органов [131]. Вместо того, Тem клетки мигрируют в периферические и

85

нелимфоидные ткани, где они могут обеспечивать эффективную цитотоксическую активность [131].

Помимо этого, во 2 триместре неосложненной беременности нами отмечалось достоверное снижение уровня центральных клеток памяти как в популяции CD4+ лимфоцитов, так и в популяции CD8+ лимфоцитов при сравнении с показателями небеременных женщин, сохранявшееся и в 3 триместре гестации в пуле Т-хелперов. Установлено, что центральные клетки памяти имеют гипо-ацетилированные гены цитокинов и не имеют или имеют низкую эффекторную функцию, хотя они могут быстро отвечать на антиген при повторной стимуляции. При этом Tcm эффективно дифференцируются в Th1 или

Th2 эффекторные клетки после стимуляции TCR в присутствии IL-12 или IL-4 [141, 87]. Как известно, Tcm не обладают эффекторными функциями, хотя они могут быстро отвечать на антиген при повторной стимуляции. Часть пула центральных клеток памяти гибнет при завершении иммунного ответа, уходя в апоптоз, часть – проходит дальнейший этап дифференцировки [134, 215].

Факторы, определившие такие изменения в содержании клеток памяти в популяции CD8+ лимфоцитов неясны. С одной стороны, у беременных женщин нами отмечалось изменение пропорции внутри популяции лимфоцитов в сторону преобладания наивных CD45RA+CD62L+ лимфоцитов [10]. С другой стороны,

уже начиная с ранних сроков гестации, патологическое развитие иммунного ответа ограничивается действием регуляторных Т-лимфоцитов [212].

На основании полученных данных нами впервые были разработаны нормативные показатели содержания наивных клеток и клеток памяти в популяциях Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов в динамике неосложненной беременности, расчет которых проводился на основе 95%

доверительного интервала.

По литературным данным известно, что развитие патологии беременности в большинстве случаев сопровождается усилением проницаемости плацентарного барьера и изменением антигенной нагрузки в результате неполноценного формирования и/или функционирования фето-плацентарного комплекса [184, 113,

86

152]. Этот факт подтверждает наше предположение о значимости стимуляции иммунной системы матери плодовыми АГ в дифференцировке клеток памяти. Об этом свидетельствует и установленный ранее факт, что стимуляция материнских цитотоксических лимфоцитов микрочастицами ворсинчатого хориона при физиологической беременности способствует повышению уровня терминально-

дифференцированных цитотоксических Т-лимфоцитов [16].

По данным литературы известно, что процесс дифференцировки Т-

лимфоцитов существенно меняется при развитии осложнений гестационного процесса [4, 24, 17]. Как показали результаты наших исследований, развитие самопроизвольного выкидыша 1 триместра гестации сопровождалось выраженными изменениями в содержании клеток, находящихся на различных этапах дифференцировки. Так, в популяции периферических Т-хелперов отмечалось снижение уровня центральных клеток памяти относительно беременных женщин с неосложненным течением гестационного процесса. В то же время, в периферической крови женщин с развившимся впоследствии ранним самопроизвольным выкидышем отмечалось достоверное увеличение содержания высокоэффекторных терминально-дифференцированных клеток памяти, как в популяции Т-хелперов, так и популяции цитотоксических Т-клеток. Это могло определяться чрезмерной антигенной стимуляцией плодовыми антигенами,

связанной с нарушениями ранних процессов формирования фето-плацентаного комплекса. Известно, что терминально-дифференцированные Т-лимфоциты являются наиболее длительно живущими клетками памяти, способными к циркуляции в кровотоке в течение всей жизни человека [95, 134, 205]. Эти клетки способны к пролиферации при непосредственном контакте с антигеном без этапа его презентации дендритными клетками и макрофагами [158].

В немногочисленных работах, посвященных этой проблеме, формирование эффекторных клеток памяти авторы связывают с усилением проницаемости плаценты для антигенов плодового происхождения [4, 24, 17]. Так, ранее было показано, что в периферической крови беременных женщин с гипертензивными расстройствами 3 триместра гестации в популяциях Т-хелперов и

87

цитотоксических Т-лимфоцитов также отмечалось увеличение доли терминально-

дифференцированных клеток памяти с фенотипом CD45RA+CD62L- [4, 17],

которые способны быстро активироваться и осуществлять эффекторную функцию непосредственно при контакте с АГ без длительного процесса его презентации

[205, 158, 95, 171].

Полученные нами результаты сочетаются с предположениями ряда исследователей о том, что при самопроизвольном выкидыше начало развития патологического иммунного ответа происходит в достаточно отдаленный период времени [9]. По литературным данным известно, что терминально-

дифференцированные лимфоциты образуются на конечном этапе дифференцировки, после длительной активации клеток, и обладают мощным цитотоксическим потенциалом, определяемым продукцией ими ряда цитокинов и цитолитических молекул [77, 95, 205, 158]. То есть развитие самопроизвольного выкидыша в 10-12 недель гестации сочеталось с формированием феномена иммунологической памяти, начиная с 4 недели беременности, так как уже в 5-8

недель гестации мы отмечали повышение уровня терминально-

дифференцированных Т-клеток памяти в этой группе.

Нарушение дифференцировки лимфоцитов может вести к изменению иммунорегуляции, определяя неадекватный иммунный ответ матери на фетальные антигены, приводя тем самым к формированию патологии беременности. Мы предположили, что при неосложненной беременности имеются механизмы, препятствующие проявлению «иммунологической памяти» материнских клеток в отношении плода, а при патологии беременности – эта защита нарушена. Наши исследования показали, что при неосложненной беременности контакт материнской иммунной системы с плодом практически не оказывает влияния на формирования «иммунологической памяти» и приводит к угнетению функции лимфоцитов, способных патологически воздействовать на плаценту и плод.

Осложнения беременности возникали у тех женщин, у которых формировались клетки «памяти», обладающие способностью повреждать

88

собственные органы и ткани, а также плаценту и плод. Причем у женщин с неосложненным течением гестационного процесса на момент обследования и развившимся впоследствии самопроизвольным выкидышем в периферической крови в максимальной степени увеличивался уровень наиболее активных терминально-диффренцированных клеток памяти, устойчивых к апоптозу [97],

обладающих мощным цитотоксическим потенциалом и способных сохранять свои свойства на протяжении всей жизни [95, 134, 205].

Таким образом, в настоящий момент можно предположить, что при неосложненной беременности на системном уровне в периферической крови действуют факторы, блокирующие формирование пула клеток памяти в популяциях Т-хелперов и ЦТЛ, что может приводить к снижению циркулирующего пула высокоактивных эффекторных Т-лимфоцитов, способных к осуществлению антиген-специфических цитотоксических реакций адаптивного иммунитета в отношении антигенов плодового происхождения.

По литературным данным известно, что на процесс дифференцировки Т-

клеток памяти может оказывать влияние IL-15 [74, 106, 108, 137]. Показано, что

IL-15 служит гомеостатическим фактором для Т-клеток памяти [11, 206]. Этот цитокин контролирует пролиферацию активированных антигеном Т-лимфоцитов

[11] и способствует выживанию клеток памяти [193, 108]. Интерлейкин-15 может синтезироваться различными типами клеток во многих органах, но в периферической крови основными его продуцентами являются моноциты [11].

Характерной особенностью данного цитокина является способность накапливаться в везикулах клетки в отсутствии активационного сигнала без секреции во внеклеточное пространство. Кроме того, IL-15 в значительной степени может существовать в виде биологически активной мембранной форме

[11].

По нашим данным с наступлением беременности уровень сывороточного

IL-15 возрастал многократно и был достоверно выше на всем ее протяжении по сравнению с показателями небеременных женщин. Это могло быть обусловлено как его синтезом de novo, так и повышенной секрецией из цитоплазматических

89

везикул или шеддингом с мембраны клеток. Однако данное повышение сывороточного уровня IL-15 при неосложненной беременности не сопровождалось ростом содержания центральных и эффекторных клеток памяти в популяциях периферических Т-лимфоцитов. Этот парадокс требует дальнейшего исследования.

У женщин с неосложненным на момент обследования течением беременности 1 триместра гестации и развившимся впоследствии ранним самопроизвольным выкидышем среднее значение содержания IL-15 было достоверно выше, чем в группе женщин с неосложненным течением беременности на всем ее протяжении. В литературе имеются данные о том, что

IL-15, производимый на ранних сроках беременности, является регулятором миграции и инвазии трофобласта и ремоделирования спиральных артерий матки

[90]. Кроме того, этот интерлейкин является мощным ингибитором апоптоза и играет крайне важную роль в плацентарном ремоделировании [91, 26]. Однако на системном уровне роль IL-15 при беременности остается неясной, но можно предположить, что в норме он способствует усилению противоинфекционной защиты матери и плода, а при патологии беременности – развитию цитотоксических реакций, направленных на отторжение плаценты и гибель плода.

Известно, что эффекторная функция CD4+ лимфоцитов определяется продукцией цитокинов, регулирующих направленность иммунного ответа [39].

Изучение особенностей функционального состояния клеток памяти при беременности показало, что со 2 триместра во фракции терминально-

дифференцированных CD4+ лимфоцитов растет содержание клеток,

продуцирующих IL-4. Эти данные хорошо согласуются с теорией T. Wegmann

(1993), постулировавшего, что нормальное развитие беременности определяется преобладанием Th2 реакций иммунного ответа. Однако был получен ряд данных,

не укладывающихся в рамки этой теории [68, 164]. Оказалось, что выявление в крови повышенного содержания Th1 комплекса цитокинов не всегда ассоциируется с неблагоприятным течением и исходом беременности и, наоборот,

при акушерской патологии может отмечаться высокий уровень Th2 цитокинов

90

[68, 164]. В нашей работе в периферической крови женщин с неосложненным течением беременности в популяции Т-хелперов во 2 триместре беременности отмечалось и увеличение уровня претерминально-дифференцированных и терминально-дифференцированных клеток памяти, продуцирующих IFNgamma+.

Следует отметить, что наиболее выраженные изменения функционального состояния клеток памяти отмечались нами во 2 триместре неосложненной беременности, а именно - в сроке 16-18 недель гестации. По данным литературы известно, что в 16-18 недель отмечается 2 волна инвазии трофобласта [20]. Можно предположить, что выявленное нами увеличение именно в этом сроке беременности уровня эффекторных популяций Tem и Temra, внутриклеточно продуцирующих интерлейкин-4 и IFNγ, является ответом на эту волну инвазии и отражает развитие материнского иммунного ответа, происходящее на локальном уровне.

В 3 триместре беременности уровни IL-4- и IFN-gamma-продуцирующих

CD4+ клеток снижались практически до показателей небеременных доноров.

Такая динамика полностью соответствует представлениям о формирования эффекторных клеток памяти, при которой на завершающем этапе при уменьшении антигенной нагрузки их уровень снижался [53]. В эти сроки беременности ответ на специфические антигены плода мог реализовываться сформировавшимися клонами клеток памяти. При этом общий баланс в соотношении фракций клеток памяти восстанавливался в результате феномена сокращения (attrition) в результате ограничения их фоновой пролиферации, так как невозможна длительная циркуляция массивных пулов Temra.

В популяции CD8+ лимфоцитов на всем протяжении неосложненной беременности основным изменением в проявлении эффекторной функции цитотоксических Т-лимфоцитов являлось угнетение продукции Perforin всеми типами клеток памяти. Известно, что Perforin является цитотоксическим белком,

содержащимся в гранулах ЦТЛ и ЕК. Perforin играет важную роль в клеточном цитолизе. При проникновении в цитоплазматическую мембранную клетки-

мишени, перфорин полимеризуется и образует поры, через которые в клетку