диссертации / 26

31

способны быстро активироваться и осуществлять эффекторную функцию непосредственно при контакте с антигеном без длительного процесса его презентации [171, 95, 205]. Одновременно в работе Лазаревой Ю.Ю. (2013)

выявлено также увеличение в крови женщин с гипертензивными расстройствами во время беременности терминально-дифференцированных клеток памяти в популяции цитотоксических Т-лимфоцитов [17].

Цитокины традиционно были предметом особого внимания со стороны исследователей, занимающихся проблемами иммунологии репродукции.

Практически вся последняя декада была посвящена гипотезе о ведущей роли цитокинов в регуляции иммунного ответа матери во время беременности [9].

Показано, что продукция цитокинов с наступлением беременности значительно меняется [22, 9, 184, 25]. Однако, несмотря на обилие работ в этой области,

механизмы поддержания цитокинового баланса во время беременности остаются до конца нераскрытыми.

Рядом авторов было показано, что дифференцировка клеток памяти происходит при контакте с антигеном и контролируется рядом цитокинов, таких как IL-2, IL-4 и IL-15 [95, 74, 106, 108, 137, 116], которые способствуют выживанию клеток и медленной гомеостатической пролиферации [180]. Так по литературным данным показано, что IL-7 и IL-15 регулирует выживаемость и самообновление в отсутствие антигена мышиных CD8+ Т клеток памяти [34, 155],

тогда как наивные клетки и CD4+ клетки памяти требуют IL-7 и TCR лигандов

[172, 173], но не отвечают на IL-15 [155]. Другие авторы утверждают что,

человеческие CD4+ Т-клетки памяти могут пролиферировать в ответ на IL-15 TCR-независимым образом и с медленной кинетикой [125], при этом отмечая разную роль IL-15 в поддержании гомеостаза CD4+ Т-клеток памяти у человека и мышей. Это связано с тем, что цитокины участвуют в осуществлении практически всех этапов гестационного процесса [9].

Особого внимания при беременности заслуживают IL-2 и IL-15, которые относятся к цитокинам, регулирующим клеточный иммунитет [11]. Рецепторы этих цитокинов имеют общую β-цепь (CD122), однако, как, показывают

32

проведенные исследования, их присутствие в микроокружении Т-лимфоцитов в результате активации приводит к формированию различных субпопуляций:

присутствие IL-2 приводит к преимущественному формированию эффекторных Т-клеток с фенотипом CD62L low, а в присутствии IL-15 формируется пул CD62L hi Т-лимфоцитов [72]. Видимо, направленность дифференцировки Т-лимфоцитов определяется силой сигнала, проведенного через молекулу CD122: слабый сигнал приводит к образованию центральных клеток памяти, а сильный к образованию эффекторных клеток [193]. Однако, несмотря на то, что IL-15 способствует дифференцировке Т-клеток в долгоживущие клетки памяти, его присутствие необходимо и для выживания короткоживущих эффекторных клеток [115].

Основными продуцентами IL-2 являются Т-хелперы, имеющие функциональные признаки Т-хелперов 1-го типа. Кроме того, синтезировать IL-2 способны также дендритные клетки [114]. В отличие от IL-2, IL-15 синтезируется различными типами клеток, в частности, моноцитами/макрофагами, эпителиальными клетками

[11]. IL-2 представляет собой секреторный цитокин, тогда как IL-15 находится в основном в виде мембранной формы [208]. IL-2 и IL-15 стимулируют пролиферацию активированных антигеном Т-лимфоцитов. В дополнение к этому

IL-15 может поддерживать пролиферацию цитотоксических Т-клеток памяти, но не наивных Т-лимфоцитов и увеличивает жизнеспособность Т-хелперов [206].

Однако в настоящее время имеются лишь единичные работы об изменении уровня IL-2 и IL-15 при патологии беременности [13, 22, 175]. Так, ранее было показано, что при угрозе прерывания беременности отмечалось увеличение содержания IL-2 в сыворотке крови по сравнению с показателями группы женщин с неосложненным течением беременности [13]. Другие исследователи отмечали снижение сывороточного уровня IL-2 при угрозе прерывания беременности в 1

триместре гестации [22]. Помимо этого, в литературе имеются данные о более высоком значении уровня IL-15 у беременных женщин 3 триместра гестации с развившейся преэклампсией по сравнению с таковым у беременных женщин с нормальным артериальным давлением [175].

Таким образом, анализ литературы показал, что в настоящее время

33

полностью отсутствуют исследования о содержании Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов, находящихся на различных этапах дифференцировки, и проявлении ими функциональной активности при неосложненной беременности в динамике гестационного процесса. В то же время изучение сложного каскада иммунологических событий, развивающихся в процессе гестационного процесса, и как показывают проведенные исследования,

сопровождающиеся динамическим изменением клеточного профиля и цитокинового фона, будет способствовать углублению наших знаний о регуляции иммунного ответа при беременности и позволит уточнить патогенетические механизмы развития различной акушерско-гинекологической патологии.

34

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Организация работы и объем исследования

Работа выполнена на базе Федерального государственного бюджетного учреждения “Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова” Министерства здравоохранения Российской Федерации (директор д.м.н. А.И. Малышкина). В работе проводилось лонгитудинальное обследование беременных женщин, вставших на диспансерный учет в территориальной женской консультации № 2 г. Иваново, в течение гестационного процесса в 1-3 триместрах. Лабораторные исследования проводились в лаборатории клинической иммунологии - зав. лабораторией заслуженный врач РФ, д.м.н., профессор Н.Ю. Сотникова.

На каждую пациентку заполнялась специально разработанная “карта обследования беременной женщины”, в которую выкопировывались данные анамнеза, результаты исследований и наблюдений из индивидуальной карты беременной и родильницы, истории родов. Каждая женщина давала письменное информированное согласие на участие в исследованиях.

Всего было обследовано:

-36 небеременных женщин (контрольная группа);

-85 беременных женщин (основная группа), обследованных лонгитудинально троекратно.

При ретроспективном анализе в зависимости от последующего характера течения гестационного процесса среди женщин основной группы были выделены подгруппы женщин:

-с неосложненным течением беременности 1 триместра гестации (5-8 недель гестации) n=76;

-с неосложненным течением беременности 2 триместра гестации (16-20 недель гестации) n=74;

-с неосложненным течением беременности 3 триместра гестации (28-32 недели

35

гестации) n=71;

- с развившимся впоследствии самопроизвольным выкидышем (10-12 недель гестации) n=9.

Контрольная группа представлена практически здоровыми женщинами фертильного возраста, с реализованной репродуктивной функцией. Отбор проводился во время планового профилактического осмотра.

Осложнений беременности у женщин основной группы на всем протяжении гестационного процесса выявлено не было. Беременность у всех женщин с неосложненным течением гестационного процесса закончилась своевременными родами.

Материалом для исследования служила периферическая венозная кровь из локтевой вены.

Исследования были одобрены локальным этическим комитетом Федерального государственного бюджетного учреждения «Ивановский научно-

исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

2.2.Иммунологические методы исследования

-Получение сыворотки периферической крови

Для исследования сывороточного содержания различных биологических продуктов кровь в количестве 1 мл отбирали в сухую центрифужную пробирку,

оставляли на 10-15 мин до полного свертывания, сгусток крови осторожно обводили по стенке пробирки длинной иглой и центрифугировали при 1500

об/мин 10 мин. Отделившуюся от сгустка сыворотку аликвотами по 200 мкл разливали в пробирки типа Эппендорф и хранили до проведения исследования в холодильнике при -200 С. При необходимости сыворотки хранили при -800С.

- Выделение мононуклеарных клеток

Для исследований методом проточной цитофлюориметрии и полимеразной цепной реакции в реальном масштабе времени (RT-PCR) кровь забирали в

36

центрифужные пробирки, содержащие 2,7 % раствор ЭДТА из расчета 3 мл крови на 1 мл раствора ЭДТА. Выделение лимфоцитов из периферической крови осуществляли традиционным методом скоростного центрифугирования при 1500

об/мин в градиенте плотности фиколл-урографина (d-1,078) [59].

- Проточная цитофлюориметрия

Поверхностный фенотип лимфоцитов и содержание клеток, внутриклеточно продуцирующих IL-4, IFNγ в популяции CD4+ лимфоцитов и Perforin и Granzyme B в популяции CD8+ лимфоцитов, определяли с помощью моноклональных антител (мАТ) методом проточной цитофлюориметрии на цитометре FACSCanto II с использованием программного обеспечения FACSDiva (Becton Dickinson,

США). В качестве флюорохромных меток использовали флюоресцеин изотиоционат (FITC), фикоэритрин (РЕ), аллофикоцианин (APC) и перидинин-

хлорофил протеин 5.5 (PerCP-Cy5.5). Фирма-производитель и клон используемых в исследовании мАТ указаны в таблице 2.2.1.

Процедуру окрашивания и фиксации клеток проводили стандартным способом в соответствии с указаниями фирмы-разработчика. При проведении проточной цитофлюориметрии клетки использовали в конечной концентрации 1 х

106 кл/мл. К 50 мкл суспензии клеток в концентрации 1 х 106 кл/мл одновременно добавляли 20 мкл мАТ, меченных PerCP-Cy5.5, 20 мкл мАТ, меченных APC и 20

мкл мАТ, меченных FITC, инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 30 минут, затем клетки отмывали в 1 мл фосфатного буфера (PBS),

содержащего 0,1% азид натрия, и фиксировали в соответствии со стандартной процедурой.

Содержание клеток, внутриклеточно продуцирующих IL-4, IFNγ в

популяции CD4+ лимфоцитов и Granzyme B, Perforin в популяции CD8+

лимфоцитов, оценивали, используя процедуру внутриклеточного окрашивания клеток с применением коммерческого набора FIX & PERM cell permeabilization reagents (Invitrogen, США) для пермеабилизации клеточной мембраны.

37

FITC – флюоресцеинизотиоцианат

PE – фикоэритрин

APC –аллофикоцианин

PerCP-Cy5.5–перидинин-хлорофил протеин 5.5

38

При проведении процедуры внутриклеточного окрашивания клетки,

предварительно меченные анти-CD4+, анти-CD8+, анти-CD62L+ и антиCD45RA+ мАТ, в соответствии со стандартным протоколом, сначала фиксировали в течение 15 мин в 100 l фиксирующего буфера А из набора FIX & PERM cell permeabilization reagents.

Далее клетки инкубировали со 100 l пермеабилизирующего буфера В и с анти-IL4-мАТ, c анти-IFNγ-мАТ, с анти-GrB-мАТ, с анти-Perf-мАТ для внутриклеточного окрашивания. В дальнейшем клетки фиксировали в соответствии со стандартной процедурой и использовали для проведения цитометрического анализа.

Для анализа неспецифического окрашивания использовали Simultest Control (мышиные IgG1-FITC + IgG2a-PE) ("Becton Dickinson", США). Для наложения оптимального окна дискриминации (гейта) для лимфоцитов на точечном графике прямого и бокового светорассеяния клетки метили анти-CD45-FITC и анти-CD14-PE

мАТ ("Becton Dickinson", США). При анализе лимфоцитарный гейт включал не менее

95-98% клеток с фенотипом CD45+CD14-. В каждом образце анализировали не менее

10000 клеток. Анализ результатов проводили в программе "CELLQuest Pro” (Becton Dickinson, USA).

-Определение уровня ДНК TREC методом RT-PCR

Процедуру выделения ДНК из лимфоцитов проводили стандартным методом согласно инструкции с использованием комплекта реагентов для выделения нуклеиновых кислот «ПРОБА-НК-ПЛЮС» фирмы «ДНК-технология»

(Россия).

Для определения экспрессии ДНК TREC в общей фракции периферических лимфоцитов использовали метод полимеразной цепной реакции (PCR) в масштабе реального времени. В работе использовали набор реагентов для определения гена

TREC (ООО «Синтол», Россия), для определения гена 18s rRNA (Biosourse,

США). Анализ производился на приборе iQCycler (Bio-Rad, США). При анализе

39

данных использовали стандартный полуколичественный Ct-метод определения уровня экспрессии ДНК специфических генов.

Для этого в каждом образце одновременно определялся пороговый цикл амплификации Ct для ДНК TREC и 18s rRNA, который использовался в качестве гена домашнего хозяйства. Затем уровень экспрессии ДНК TREC нормализовали относительно экспрессии ДНК 18s rRNA. Для этого рассчитывался показатель Ct

по формуле: Ct=Ct-TREC - Ct-18s rRNA, где

Ct TREC – цикл начала амплификации для гена TREC,

Ct 18s rRNA – цикл начала амплификации для гена 18s rRNA.

Для полуколичественной оценки результатов RT-PCR, уровень экспрессии ДНК TREC в группе беременных женщин нормализовали относительно соответствующего показателя в контрольной группе. Для этого рассчитывался коэффициент RQ (related quantity) по стандартной формуле [79].

RQ= 2^ (- Ct), где

Ct = Ct беременные женщиныCt контроль

Таким образом, все результаты представлены как n-кратные различия между соответствующими показателями в группе беременных женщин и небеременных доноров.

ПЦР ставили с использованием набора реагентов TaqMan Universal PCR Master Mix («Applied Biosystems», США) в объеме 25 мкл: 1 цикл - 50ºС 2 мин, 95ºС 10 мин; 45 циклов - 95ºС 15 сек, 60ºС 1 мин, использовали прибор “7300

Real-Time PCR System” («Applied Biosystems», США).

-Определение содержания цитокинов методом ELISA

Содержание цитокинов в сыворотке периферической крови определяли методом ELISA на микропланшетном ридере Multiscan EX (Labsystems,

Финляндия). Анализ и интерпретацию результатов осуществляли в соответствии с рекомендациями фирмы-разработчика. В таблице 2.2.2 представлена характеристика использовавшихся в работе тест-систем для проведения ELISA.

40

2.3. Статистическая обработка данных

Статистическая обработка данных проводилась по общепринятым методам вариационной статистики после проверки рядов на нормальность распределения по критериям Колмагорова-Смирнова, Лиллифорса и Шапиро-Уилка [26]. В тех случаях, когда распределение значений показателей соответствовало нормальному, достоверность различий показателей в группах определялась по t-

критерию Стьюдента. В тех случаях, когда распределение не соответствовало нормальному, использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни.

Расчет нормативных показателей содержания наивных клеток,

центральных, претерминально-дифференцированных и терминально-

дифференцированных клеток памяти в популяциях CD4+ и CD8+ лимфоцитов периферической крови проводился на основе 95% доверительного интервала.

Статистический анализ осуществлялся в пакете прикладных лицензионных программ “Statistica 6.0.”, “Microsoft Office 2007”, “MedCalc”.

Общее количество проведенных лабораторных исследований составило

3312 (табл. 2.3.1.).