диссертации / 26

2

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………..……4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………...13

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ……………………….....34

2.1.Организация работы и объем исследований .……………………………34

2.2.Иммунологические методы исследования .……………………………...35

2.3Статистическая обработка данных…………..……………………………40

Глава 3. ХАРАКТЕРИСТИКА ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ И ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ Т-ЛИМФОЦИТОВ В ДИНАМИКЕ НЕОСЛОЖНЕННОЙ БЕРЕМЕННОСТИ И У ЖЕНЩИН С РАЗВИВШИМСЯ ВПОСЛЕДСТВИИ САМОПРОИЗВОЛЬНЫМ ВЫКИДЫШЕМ………………………………………...42

3.1.Особенности внетимической дифференцировки наивных Т-лимфоцитов в популяциях Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов периферической крови при неосложненной беременности в динамике гестационного процесса………....42

3.2.Особенности дифференцировки клеток памяти в популяциях Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов периферической крови при неосложненной беременности в динамике гестационного процесса………………………………...50

3.3.Особенности дифференцировки Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов периферической крови женщин с развившимся впоследствии самопроизвольным выкидышем……………………………………………………………………………56

3.4.Характеристика внутриклеточной продукции цитокинов и цитолитических молекул наивными клетками и клетками памяти в популяциях Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов периферической крови при неосложненной беременности в динамике гестационного процесса ………………………………..61

Глава 4. СОДЕРЖАНИЕ IL-2 И IL-15 В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ В ДИНАМИКЕ НЕОСЛОЖНЕННОЙ БЕРЕМЕННОСТИ И У ЖЕНЩИН С РАЗВИВШИМСЯ ВПОСЛЕДСТВИИ САМОПРОИЗВОЛЬНЫМ ВЫКИДЫШЕМ……………………………………………………………………….69

Глава 5. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ………………………73

3

ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………………………………….93

ВЫВОДЫ……………………………………………………………………...............94

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ……………………………………………...97

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ…………………………………………………………...99

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………………….......100

4

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность научного исследования

В настоящее время известно, что иммунные механизмы играют крайне важную роль в развитии беременности, определяя формирование маточно-

плацентарного комплекса и обеспечивая сосуществование двух семиаллогенных организмов [9]. Нарушение тех или иных звеньев в сложной цепочке иммунорегуляции ведет к возникновению патологических процессов в системе мать-плацента-плод [171, 9, 182, 47].

Популяция Т-хелперов является важнейшим звеном в запуске реакций адаптивного иммунитета, при этом усиление функциональной активности той или иной субпопуляции Т-хелперов определяет тип иммунного ответа [39].

Цитотоксические Т-лимфоциты являются одним из основных компонентов эффекторной стадии иммунного ответа, осуществляющие цитолитическое действие в отношении различных клеток-мишеней благодаря продукции большого количества цитокинов и цитолитических молекул [39]. В последние годы было показано, что уровень функциональной активности Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов определяется стадией их дифференцировки [105, 86, 77, 95, 171]. При этом различают 4 пула Т-лимфоцитов, которые получили название наивных клеток, центральных, претерминально-дифференцированных и терминально-дифференцированных клеток памяти, характеризующихся различной экспрессией ряда функциональных и адгезионных молекул [30, 19, 95, 171]. Переход клеток на новую стадию дифференцировки определяет путь рециркуляции клеток через лимфоидную ткань, изменяет их цитолитические свойства, продукцию цитокинов и цитолитических молекул [77, 178, 105].

Однако в литературе практически отсутствуют данные о характере дифференцировки Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов при неосложненном течении беременности в динамике гестационного процесса.

Известно, что беременность сопровождается инволюцией тимуса,

выраженной в снижении его массы и клеточности [210, 43, 84]. Предполагается,

5

что во время беременности механизмом компенсации частичного подавления тимического пути развития лимфоцитов, является процесс экстратимической дифференцировки Т-клеток [35, 42]. Так в работах ряда авторов показано, что экстратимическая дифференцировка лимфоцитов может проходить в лимфатических узлах, дренирующих матку, в децидуальной оболочке матки и в печени [35, 42]. Однако данный механизм поддержания пула Т-лимфоцитов при беременности не исследовался. В настоящее время для изучения функциональной активности тимуса предлагается определять в лимфоцитах кольца реаранжировки генов α-цепи антигенраспознающего рецептора или TREC [65, 186]. В литературе представлены работы о снижении уровня TREC при различных патологических состояниях [160, 54, 78, 104, 188]. Можно предположить, что и при беременности,

которая сопровождается транзиторной атрофией тимуса, должен изменяться уровень экспрессии TREC периферическими Т-лимфоцитами. Однако данные об изменении количества TREC при беременности крайне малочисленны.

В связи с этим планируемая работа является актуальной и позволит уточнить особенности поддержания иммунного гомеостаза во время беременности.

Цель работы – установить особенности поддержания иммунного гомеостаза в динамике гестационного процесса с учетом дифференцировки наивных Т-клеток и Т-клеток памяти, на основании чего разработать новый способ прогнозирования раннего самопроизвольного выкидыша.

Задачи научного исследования

1.Выявить особенности дифференцировки клеток памяти в популяциях Т-

хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов периферической крови в динамике гестационного процесса.

2.Оценить содержание клеток памяти, внутриклеточно продуцирующих цитокины и цитолитические молекулы, в популяциях Т-хелперов (IL-4,

6

IFNγ) и цитотоксических Т-лимфоцитов (Perforin и Granzyme B) в динамике

гестационного процесса.

3.Выявить особенности содержания IL-2 и IL-15 в сыворотке периферической крови в динамике гестационного процесса.

4.Оценить уровень ранних тимических эмигрантов на основании изучения содержания CD31+thymic и СD31-central клеток в популяциях периферических Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов и экспрессии ДНК TREC Т-

лимфоцитами в динамике гестационного процесса.

5.Разработать способ прогнозирования раннего самопроизвольного выкидыша у женщин с неосложненной на момент обследования беременностью.

Научная новизна исследования

Впервые установлено, что неосложненное течение беременности сочетается с изменением характера дифференцировки наивных клеток и клеток памяти и их функциональной активности, как в популяции Т-хелперов, так и популяции цитотоксических Т-лимфоцитов.

Выявлено, что отличительной чертой дифференцировки клеток памяти у беременных женщин является снижение содержания в периферической крови во 2

и 3 триместрах центральных клеток памяти в популяции Т-хелперов, а в популяции цитотоксических Т-лимфоцитов уменьшение уровня претерминально-

дифференцированных клеток памяти в 1 и 2 триместрах.

Установлено, что для беременных женщин характерно изменение продукции цитокинов разными субпопуляциями клеток памяти: в популяции Т-

хелперов усилена внутриклеточная продукция IL-4 и IFNγ наивными клетками в 1

триместре, повышена продукция IFNγ в пулах претерминально- и терминально-

дифференцированных клеток и IL-4 в пуле терминально-дифференцированных клеток во 2 триместре; в популяции ЦТЛ снижена внутриклеточная продукция

Perforin центральными и претерминально-дифференцированными клетками

7

памяти, повышена выработка Granzyme B наивными клетками в 1 триместре,

снижена продукция Perforin всеми типами клеток памяти во 2 триместре, снижена продукция Perforin центральными, претерминально- и терминально дифференцированными клетками памяти в 3 триместре.

Показано, что содержание различных пулов клеток памяти и их функциональная активность меняются в зависимости от срока гестации: в

популяции цитотоксических Т-лимфоцитов уровень центральных клеток памяти снижается во 2 триместре по сравнению с показателями 1 триместра, в 3

триместре количество претерминально-дифференцированных ЦТЛ повышается по сравнению с таковым во 2 триместре; также во 2 триместре относительно 1

триместра увеличивается внутриклеточная продукция IL-4+ и IFNγ+

терминально-дифференцированными клетками в популяции Т-хелперов;

снижается выработка Perforin наивными клетками и терминально-

дифференцированными клетками, а также уровень Granzyme B наивными клетками в популяции цитотоксических Т-лимфоцитов; в 3 триместре уменьшается внутриклеточная продукция IFNγ претерминально- и терминально-

дифференцированными клетками и IL-4 терминально-дифференцированными клетками памяти в популяции Т-хелперов, но повышается продукция Perforin

наивными цитотоксическими Т-клетками.

Установлено, что во время беременности повышается сывороточный уровень IL-2 в 1 и 2 триместрах и IL-15 на протяжении всего гестационного периода.

Показано, что во время неосложненной беременности в отличие от небеременных женщин увеличено содержание наивных клеток в популяции Т-

хелперов на протяжении всего гестационного периода и в популяции цитотоксических Т-лимфоцитов - в 1, 2 триместрах, что сочетается со снижением в крови уровня ранних эмигрантов из тимуса в популяциях и Т-хелперов, и ЦТЛ,

при этом уровень экспрессии ДНК TREC снижается во 2 триместре.

Впервые выявлено, что снижение в 5-8 недель беременности в периферической крови уровня центральных клеток памяти в популяции Т-

8

хелперов на фоне повышения содержания терминально-дифференцированных клеток памяти в популяциях Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов, а также повышение сывороточного уровня IL-15 предшествуют развитию самопроизвольного выкидыша в 10-12 недель беременности.

Впервые установлено, что высокое содержание в периферической крови

CD45RA+CD62L+ лимфоцитов в популяции Т-хелперов является прогностическим критерием раннего самопроизвольного выкидыша.

Методология и методы исследования

Для достижения поставленной цели в работе было проведено обследование

85 женщин лонгитудинально в динамике гестационного процесса в 1 (5-8 недель гестации), 2 (16-20 недель гестации) и 3 (28-32 недели гестации) триместрах беременности, обратившихся в территориальную женскую консультацию № 2 г. Иваново для ведения беременности. При обследовании женщин использовался комплекс современных иммунологических методов - многоцветная проточная цитометрия, PCR в масштабе реального времени, твердофазный ИФА.

Статистическая обработка результатов исследования проводилась с использованием пакета современных компьютерных программ прикладного статистического анализа.

Положения, выносимые на защиту

Развитие гестационного процесса ассоциируется с изменением дифференцировки и функциональной активности наивных Т-клеток и Т-клеток памяти. Начиная с ранних сроков при неосложненной беременности, в результате воздействия антигенов плодового происхождения и стимулирующего влияния IL-

2 и IL-15, в периферической крови усиливается процесс экстратимической дифференцировки наивных клеток в популяциях Th1, Th2 и цитотоксических Т-

9

лимфоцитов без последующего образования центральных и эффекторных клеток памяти, на фоне угнетения цитолитического потенциала клеток памяти.

Чрезмерная стимуляция антигенами плода на фоне повышения сывороточного уровня IL-15 определяет усиление дифференцировки клеток памяти в популяциях Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов до терминальных этапов, что может приводить к развитию цитотоксических реакций, направленных на преждевременное прерывание беременности.

Высокое содержание CD45RA+CD62L+ клеток в популяции CD4+

лимфоцитов периферической крови является прогностическим критерием раннего самопроизвольного выкидыша.

Практическая значимость научного исследования

В гинекологической практике предлагается использовать новый способ прогнозирования раннего самопроизвольного выкидыша, основанный на определении в периферической крови относительного содержания

CD45RA+CD62L+ клеток в популяции CD4+ лимфоцитов.

Установлены нормативные показатели содержания наивных клеток,

центральных, претерминально-дифференцированных и терминально-

дифференцированных клеток памяти в популяциях Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов периферической крови в динамике гестационного процесса.

Внедрение результатов работы в практику

Разработанный «Способ прогнозирования самопроизвольного выкидыша»

(положительное решение о выдаче патента от 14.05.2014г) прошел предрегистрационное испытание в гинекологической клиники Федерального государственного бюджетного учреждения «Ивановский научно-

исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

10

Нормативные показатели содержания наивных клеток, центральных,

претерминально-дифференцированных и терминально-дифференцированных клеток памяти в популяциях Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов периферической крови в динамике гестационного процесса используются в работе врачей акушеров-гинекологов гинекологической клиники Федерального государственного бюджетного учреждения «Ивановский научно-

исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова» Министерства здравоохранения Российской Федерации и в учебном процессе на кафедре патофизиологии, клинической патофизиологии и иммунологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ивановская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Степень достоверности полученных результатов подтверждается достаточным количеством клинических наблюдений. Обследованы 85

беременных женщин лонгитудинально троекратно в динамике 1-3 триместров гестации и 36 практически здоровых небеременных женщин фертильного возраста.

Личное участие автора

Автором самостоятельно проводился отбор пациенток на основании заключений врачей акушеров-гинекологов. Автор лично осуществлял все этапы иммунологических исследований, проводил систематизацию, статистико-

математическую обработку данных, анализ и описание полученных результатов;

сформулированы выводы и практические рекомендации.