Методичка. Воробьев

КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Институт фундаментальной медицины и биологии Кафедра физиологии и биохимии растений

ПРАКТИКУМ ПО ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ РАСТЕНИЙ

ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЯ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

(внеклеточное отведение)

Учебно-методическое пособие

КАЗАНЬ2013

УДК 581.1

Печатается по решению Редакционно-издательского совета ФГАОУВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет»

учебно-методической комиссии Института фундаментальной медицины и биологии

Протокол № 1 от 21 марта 2013 г.

заседания кафедры физиологии и биохимии растений Протокол №2 от 21 марта 2013 г.

Составитель: канд. биол. наук, доцент В.Н. Воробьев

Рецензент

д.б.н, проф., зав. каф. биоэкологии И.И. Рахимов

Практикум по физиологии и биохимии растений. Электрофизиология высших растений (внеклеточное отведение): Учебно-методическое пособие /В.Н. Воробьев.- Казань: Казанский университет, 2013 – 32 с.

Настоящее учебно-методическое пособие является частью содержания практикума по физиологии и биохимии растений, проводимого на кафедре физиологии и биохимии растений. В пособии рассмотрены основные виды биоэлектрической активности клеток высших растений. Изложены методы внеклеточного отведения для регистрации биоэлектрических реакций, таких как тканевой потенциал, потенциал действия и его распространение, вариабельный потенциал и светозависимая биоэлектрическая активность.

Пособие предназначено для студентов, бакалавров, магистров и аспирантов, изучающих биоэлектрическую активность высших растений.

©Казанский университет, 2013 ©Воробьев В.Н., 2013

2

ВВЕДЕНИЕ.

К числу наиболее удивительных свойств живых клеток, несомненно, следует отнести их способность генерировать биоэлектрические потенциалы. Обнаруженное в середине прошлого столетия биоэлектричество привлекло к себе внимание исследователей самых разных направлений физиков, физикохимиков, биологов. Изучение биоэлектрических явлений приобрело многоплановый характер. Одним из существенных направлений, получивших развитие, явилось изучение биоэлектрогенеза – непосредственных причин, лежащих в основе генерации биоэлектрических потенциалов. Очевидно, что без знания механизмов возникновения электрических потенциалов в клетке невозможно в полной мере оценить их роль в различных функциях клеток, тканей и организма в целом.

Если механизм биоэлектрогенеза у животных к настоящему времени изучен достаточно полно, то в отношении растений этого нельзя сказать. Большая часть исследований в электрофизиологии растений выполнена на гигантских клетках харовых водорослей. Хотя водоросли могут рассматриваться как обобщенная модель растительной клетки, им, несомненно, присущи и специфические особенности, отличающие их от высших растений. Поэтому анализ природы и закономерностей биоэлектрических потенциалов у растений представляется весьма актуальным.

К сожалению, при работе с высшими растениями многие методические подходы, обеспечивающие успех в решении многих вопросов биоэлектрогенеза у животных (микроэлектродная техника, метод фиксации напряжения, пэтч-клямп метод и др.), часто оказываются трудно применимыми из-за сложной структуры отдельных органов растений. Вместе с тем результаты исследований все более убеждают в том, что процесс генерации биопотенциалов, как у животных, так и у растений не только сопровождает те или иные жизненно важные процессы, но играет нередко ключевую роль в их протекании.

По крайней мере, три аспекта представляются наиболее важными в этом отношении.

3

Во-первых, роль биоэлектрических потенциалов в протекании энергетических превращений. Стало очевидным, что разности биоэлектрических потенциалов на мембранных структурах животных и растительных клеток являются наряду с АТФ обобщенной формой конвертируемой энергии. Речь идет о биоэлектрических потенциалах внутриклеточных мембранных систем и плазмалеммы. Здесь энергия электрического поля, напряженность которого весьма высока, используется при совершении осмотической, механической и других видов работ. Поэтому нередко для характеристики степени энергизованности клетки используют величину ее мембранного потенциала.

Во-вторых, роль биоэлектрических потенциалов в регуляции клеточных процессов. Так, хорошо известно, что величина электрического поля на мембране регулирует состояние ряда ионных каналов и активность некоторых ферментов. Под контролем разности мембранных потенциалов находятся сами системы, ответственные за биоэлектрогенез растительных клеток (например К+-АТФаза, Н+-АТФаза) (Опритов, 2000).

В-третьих, сигнальная роль биоэлектрических потенциалов, которая в наиболее совершенной форме представлена в нервах животных, имеет место также и у других живых объектов, в том числе у высших растений. Появляется все больше фактов, которые подтверждают идеи, выдвинутые в начале ХХ в. Выдающимся индийским ученым Боссом, о том, что в ответ на внешнее воздействие у растений могут генерироваться биоэлектрические импульсы, по природе во многом сходные с потенциалами действия нервных волокон. Изучение этих импульсов у растений представляется особенно важным в связи с сравнительно-эволюционной оценкой процесса распространяющегося возбуждения и выяснением природы быстрых функциональных связей между отдельными органами растительного организма.

Генерация биоэлектрических потенциалов у высших растений обладает не только чертами сходства с таковой у животных, но характеризуется и рядом специфических особенностей (Опритов и др., 1996б).

В настоящем пособии студентам предлагается опытным путем подтвердить наличие электрического мембранного потенциала, различных биоэлектрических реакций в ответ на внешнее воздействие у высших растений. Основная часть пособия посвящена экстраклеточному отведению

4

биопотенциалов, так как данный метод не трабует специальной подготовки и относительно прост в исполнении.

МЕТОДИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ИЗМЕРЕНИЯ ПОТЕНЦИАЛОВ ПОКОЯ КЛЕТОК ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ.

Биоэлектрическая активность клеток высших растений в покое может быть измерена, как у животных объектов, различными методами. Это, прежде всего внутриклеточное и внеклеточное отведение биоэлектрической активности. Мембранный потенциал покоя (E’m ) - это разность потенциалов между внешней и внутренней сторонами мембраны.

Внутриклеточное измерение. Измерение E’m клеток высших растений посредством микроэлектродной техники, несмотря на большой прогресс, достигнутый в ее совершенствовании, до сих пор представляет собой весьма непростую задачу. Дело в том, что клетки высших растений наряду с жесткой клеточной стенкой и высоким тургорным давлением, характерным и для клеток харовых водорослей, имеют, в отличие от последних, очень небольшие размеры. В этой связи удачное введение микроэлектрода в клетку высшего растения, позволяющее осуществить достаточно длительный эксперимент (в течение часа и более), требует от исследователя значительного навыка работы с такими клетками.

Микроэлектроды, используемые для измерения E’m клеток высших растений изготавливают обычно из стекла «Пирекс». Диаметр кончика электрода, с учетом малых размеров клеток, не должен превышать 1 мкм. Микроэлектроды с большим диаметром при введении, как правило, сильно повреждают клетки высших растений.

Введение микроэлектродов осуществляют с помощью микроманипулятора под углом 30-600 к плоскости объекта (речь чаще всего о поверхности среза) и при визуальном контроле через микроскоп с большим увеличением (200 и более). Горизонтальное и вертикальное введение микроэлектрода в растительную ткань осуществляется в «слепую» и используется гораздо реже. Число повторных введений одного и того же микроэлектрода, учитывая большую вероятность притупления или слома его

5

кончика о жесткую клеточную стенку, должно быть минимальным. Для предотвращения попадания содержимого обладающих тургором клеток в канал введенного микроэлектрода последний заполняют гелем. С этой целью электролит (например KCl 3M), предназначенный для заполнения электрода, может быть приготовлен на 2% агаре.

Измерение мембранного потенциала клеток высших растений производят по отношению к водной среде окружающей клетки в экспериментальной кювете. В это связи некоторые авторы, работающие с наземными высшими растениями, отмечают, что водная среда не является естественным условием обитания, например, для клеток поверхностных тканей листьев и стремятся использовать методические приемы, позволяющие свести к минимуму число контактирующих клеток с внешней водной средой. Однако, измеряемые при этом потенциалы покоя и их регистрация в ответ на действие различных химических агентов, судя по всему, ничем не отличается от таковых в экспериментах с традиционной методикой (Опритов и др., 1991).

Регистрацию измеряемых мембранных потенциалов клеток высших растений осуществляют обычно на специальной регистрирующей аппаратуре с высоким входным сопротивлением, которое превышает сопротивление микроэлектрода более чем в 100 раз. Величина измеряемых мембранных потенциалов в большой мере зависит от степени шунтирования микроэлектродом таких клеточных мембран как плазмалемма и тонопласт.

Следует отметить, что помимо мембранного потенциала с помощью микроэлектродной техники могут быть также исследованы такие электрические характеристики мембран клеток высших растений, как омическое сопротивление, вольт-амперная характеристика и другие. Методом петч-клямп, получившим большое распространение в последнее время, в опытах на изолированных протопластах и вакуолях клеток высших растений при использовании микроэлектродов в качестве микроприсосок осуществляется анализ проводимости одиночных ионных каналов.

Внеклеточное измерение. Принцип внеклеточной регистрации биоэлектрической активности клеток высшего растения в покое основан на симпластической природе электрической полярности данного объекта. При этом разность потенциалов U1,2 между двумя точками поверхности, например, стебля растения, может быть описана уравнением

6

(1)

где r1 – сопротивление внешней среды; r2- сопротивление симпласта; Em1 и Em2

– мембранные потенциалы симпласта в точках 1 и 2; Δφ – вклад апопласта в электрическую полярность объекта (обычно не существенен). Из уравнения 1 следует, что измеряемая внеклеточная разность потенциалов позволяет в той или иной степени судить лишь об изменениях мембранного потенциала клеток высшего растения в зоне отведения (например под влиянием какоголибо воздействия), но не о стационарных уровнях мембранного потенциала.

Типичным примером внеклеточно-регистрируемой разности потенциалов может служить так называемый биоэлектрический тканевой потенциал. Он возникает между апикальным и базальным концами отрезка стебля или корня высшего растения при воздействии на один из них (обычно апикальный) каким-либо фактором. При этом показательно, что исходно разность потенциалов между концами такого отрезка отсутствует или не превышает

±10 мВ.

Внеклеточное отведение разности потенциалов в покое может осуществляться как от одного высшего растения, так и одновременно от целой группы растений (при одном канале измерения). В последнем случае регистратор запишет усредненное значение разности потенциала всей использованной совокупности растений, что весьма существенно для получения статистически значимого результата, особенно при экспрессанализе (Орлов и др., 2009).

Для внеклеточного отведения чаще всего применяют неполяризующиеся микроэлектроды (каломельные и хлорсеребрянные). Могут использоваться, в часности, вспомогательные электроды, предназначенные для рН-метрических измерений. На такие электроды, заполненные насыщенным раствором KCl, надевают переходные насадки со смоченными слабым ионным раствором (водопроводная вода, 0.1% KCl, искусственная прудовая вода и т.д.) фитильками из ваты, марли, шерсти или асбеста. Они служат для обеспечения «мягкого» контакта с поверхностью растения, смачивания зоны контакта и

7

предотвращения неблагоприятного воздействия на клетки растения, вытекающего из электродов электролита.

Определение разности биоэлектрического тканевого потенциала методом внеклеточного отведения между корнем и гипокотелем.

Способность к генерации электрических потенциалов (биоэлектрогенез) является универсальным свойством живых систем (Опритов и др., 1991). У растений биоэлектрогенез тесно связан с транспортом ионов через плазматическую мембрану, фотосинтезом (Булычев, 1989), дыханием (Bulychev, Vredenberg, 1995) и многими другими процессами, протекающими в растительном объекте. Зависимость растительного биоэлектрогенеза от метаболизма открывает возможность применения показателей процессов электрогенеза для оценки состояния растения, в том числе – его устойчивости

кдействию неблагоприятных факторов.

Влитературе имеются работы, обосновывающие использование потенциалов покоя (а также обусловленных ими показателей, включая разность потенциалов (РП) между участками растения) и потенциалов возбуждения для оценки устойчивости растительных объектов к действию стресс-факторов (Stahlberg, 2006). Однако относительно слабо изученной остается возможность применения РП в качестве показателя устойчивости растений к действию тех или иных стресс-факторов при исследовании влияния на такую устойчивость различных модулирующих условий.

Разность потенциалов между корнем и побегом может быть использована в качестве показателя солеустойчивости проростков пшеницы. Можно предположить, что связующим звеном между изменениями РП и солеустойчивостью (которая, вероятно, отражает возрастание неспецифической устойчивости растения) служит величина энергизации клетки. В пользу этого предположения свидетельствует, с одной стороны, сильная зависимость потенциала покоя растений от метаболизма, в частности от энергизации (Allakhverdiev et all., 2005), благодаря чему метаболические процессы могут оказывать значительное влияние и на РП, а с другой – показанное в ряде работ положительное влияние возрастания содержания

8

Для определения разности потенциалов прибор рН-метр-иономер Эксперт 001 переводят в рабочее положение. Выбрав режим измерения потенциалов – нажать «измерение» на экране появятся данные характеризующие разность потенциалов между электродами.

Результат измерения фиксируют. После установления стабильного показателя (mV) в емкость с корнями добавляют 10 мл 1 М раствор NaCL и с

9

интервалом в 5 минут фиксируют показания разности потенциалов (РП). По результатам исследования строят график зависимости РП от времени нахождения корней в растворе хлорида натрия.

Определение биоэлектрического тканевого потенциала методом внеклеточного отведения.

Цель: Определить разность электрических потенциалов (ΔU) между апикальным и базальным концами стебля проростка гороха при различных расстояниях между электродами.

Оборудование: рН-метр-иономер Эксперт 001, хлорсеребряные электроды, ватный тампон, проростки гороха, штатив и зажимы для закрепления объектов исследования, скотч для фиксации электрода.

Ход работы.

С помощью предварительно нарезанных полосок скотча, через ватный тампон, смоченный водопроводной водой, проросток гороха закрепляют на электродах (см. рис. 2). В первом варианте на расстоянии 1 см, во втором – 2 см, в третьем – 3 см, в четвертом – 4 см. Результаты измерений заносят в табл.1, сравнивают и на их основании делают вывод о зависимости ΔU от расстояния между электродами.

Рис. 2. Схема закрепления электродов на стебле.

10