Вопрос 13) .

Методы определения и способы выражения активности ферментов.

Активность ферментов

Содержание ферментов в биологических жидкостях оценивается, как правило, по величине их каталитической активности, в некоторых случаях - по концентрации энзима как белка.

Референтные значения для активности ферментов плазмы кроме условий измерения, связаны также с физиологическим состоянием пациента (беременность), возраст, пол, проводимым лечением и другими факторами.

Измерение концентрации фермента иммуноферментными или иммунохимическими методами более специфично и менее подвержено аналитическим вариациям, но, как правило, существенно дороже, чем измерение активности.

В системе СИ за единицу фермента принят, катал (кат) - это такое количество энзима, которое катализирует превращение 1 моля субстрата за 1 секунду.

1 Ед/л = 16,67 нкат/л

1 нкат = 0,06 Ед/л

Методы определения активности ферментов

Методы определения активности ферментов, применяемые в КДЛ, основываются, за небольшим исключением, на фотометрическом измерении образующихся в результате реакции продуктов или потреблении субстратов. Если продукты реакции окрашены, их можно непосредственно фотометрировать, однако в большинстве случаев нужны дополнительные химические процедуры (реакции) для фотометрической регистрации хода реакции.

По способу измерения скорости ферментативной реакции различают:

1. измерение по конечной точке (end point method). При этом определяют содержание продуктов реакции в инкубационной среде после фиксированного времени инкубации и остановки ферментативной реакции (как правило с использованием агрессивных сред);

2. кинетическое измерение (kinetic measurement) с непрерывным (многоточечным) измерением абсорбции в ходе ферментативной реакции (рис. А);

3. измерение по начальной скорости (initial rate), когда скорость реакции нелинейна, скорость изменения абсорбции снижается во времени (рис. Б);

4. двухточечное измерение (two point) - при этом способе выбирают линейный участок кривой, определяют абсорбцию дважды - в начале измерения и в конце (рис. В). Хотя это также кинетическое измерение, однако, термин «кинетическое» принят в клинической химии для измерений, в которых регистрируется более 2 точек. Двухточечное измерение потенциально включает возможность нескольких методических ошибок. Если реакция проходит с очень высокой скоростью, то реакция может замедлиться или вообще прекратиться из-за потребления всего количества субстрата.

Вопрос 14.) Клиническое значение определения активности ферментов в биологических жидкостях.

Клиническое значение ферментов. 

Известен ряд заболеваний и патологических состояний, в основе которых лежит недостаточность тех или иных ферментов. Многие из таких нарушений являются наследственными или врожденными. Широко известна, напр., непереносимость молока, возникающая вследствие низкой активности или полного отсутствия в клетках слизистой оболочки кишечника фермента бета-галактозидазы, в результате чего не может произойти переваривание молочного сахара - лактозы. Примерно у одного из 15-20 тыс. детей наблюдается тяжелое наследственное заболевание, известное под названием "фенилкетонурия", или "фенилпировиноградная олигофрения". Причина его - низкая активность фермента фенилаланинмонооксигеназы, катализирующей превращение фенилаланина в тирозин. Достаточно подробно изучены врожденные болезни, связанные с недостаточностью ферментов, катализирующих расщепление гликогена.  К числу заболеваний, связанных с нарушением активности ферментов, следует отнести и многие гиповитаминозы. Так, бери-бери связана с недостатком витамина В1 (тиамина), в результате чего перестает функционировать специфическая декарбоксилаза, в активный центр к-рой входит тиамин.  Определение активности ферментов в биологических жидкостях и в тканях играет значительную роль в лабораторной диагностике различных заболеваний, так наз. энзимодиагностике.  Ферменты нередко используются как реактивы, с помощью которых определяют содержание других веществ в жидкостях и тканях организма. Напр., уреазу применяют для определения концентрации мочевины в моче и крови. Широкое распространение в лабораторной практике получил простой и специфичный метод определения концентрации глюкозы в крови и моче с помощью глюкозооксидазы.