Биологически активные вещества в биотехнологии

ва, которые содержат не менее двух пептидных групп, например биурет H2N CO NH CO N2H.

На основе биуретовой реакции разработаны методы количественного определения белков.

2. Нингидриновая реакция на α-аминогруппу. Метод осно-

ван на взаимодействии нингидрина с α-аминогруппой аминокислот, пептидов, белков с образованием окрашенного комплекса синего или сине-фиолетового цвета. В этой реакции α-аминокислоты и пептиды окисляются нингидрином и подвергаются окислительному дезаминированию, декарбоксилированию с образованием аммиака, альдегида и СО2. Нингидрин восстанавливается и связывается со второй молекулой нингидрина посредством молекулы аммиака, образуя продукты конденсации, окрашенные в синий, фиолетовый, красный, а в случае пролина – в желтый цвет. Химизм нингидриновой реакции:

К 5 каплям исследуемого раствора приливают 5 капель 0,1%-ного водного раствора нингидрина, нагревают до кипения и через 1 3 мин наблюдаютпоявлениеокрашивания.

Нингидриновая реакция может быть положительна с некоторыми аминами и амидами кислот.

Нингидриновая реакция может быть использована для количественного определения α-аминокислот.

21

3. Ксантопротеиновая реакция на ароматические амино-

кислоты. Метод основан на способности аминокислот, содержащих ароматическое кольцо, образовывать при взаимодействии с концентрированной азотной кислотой динитропроизводные соединения желтого цвета. В щелочной среде они переходят в хиноидные структуры, имеющие оранжевое окрашивание. Ксантопротеиновая реакция характерна для фенилаланина, тирозина и триптофана, имеющих ароматическое кольцо.

К 5 каплям исследуемого раствора добавляют 3 капли концентрированной азотной кислоты и осторожно кипятят. Сначала появляется осадок свернувшегося под влиянием кислоты белка, который при нагревании окрашивается в желтый цвет. После охлаждения в пробирку наливают по каплям 10%-ный раствор NaOH до оранжевого окрашивания.

хиноидной структуры оранжевого цвета

Ксантропротеиновая реакция положительна со многими ароматическими соединениями (бензол, фенол и др.). Ксантопротеиновая реакция обеспечивает появление желтого окрашивания при попадании концентрированной азотной кислоты на кожу, ногти.

4. Реакция Адамкевича на триптофан. Метод основан на способности триптофана в кислой среде реагировать с глиоксиловой кислотой с образованием соединения, окрашенного в краснофиолетовый цвет. При нагревании две молекулы триптофана взаимо-

22

действуют с глиоксиловой кислотой с образованием окрашенного соединения. Для проведения реакции используют ледяную уксусную кислоту, в которой как примесь содержится глиоксиловая кислота. В качестве водоотнимающего средства в реакции используется концентрированная серная кислота.

К 2 каплям исследуемого раствора добавляют 10 капель ледяной уксусной кислоты и осторожно нагревают до растворения выпавшего осадка белка, после чего содержимое охлаждают. Очень осторожно по стенке, наклонив пробирку, подслаивают из пипетки около 1 мл концентрированной серной кислоты, следя за тем, чтобы жидкости не смешивались. На границе двух слоев возникает характерное окрашенное кольцо, которое постепенно распространяется на весь раствор.

5. Реакция Фоля на аминокислоты, содержащие слабосвя-

занную серу. Метод основан на способности белков, в состав которых входят цистеин и цистин, в щелочной среде при нагревании образовывать сульфид натрия, который с плюмбитом натрия дает черный или бурый осадок сульфида свинца.

Pb(CH3COO)2 + 2NaOH → Pb (OH)2 + 2CH3COONa

Pb(OH)2 + 2NaOH → Na2PbO2 + 2H2O

Na2S + Na2PbO2 + 2H2O → PbS↓ + 4NaOH

23

В пробирку наливают 10 капель 5%-ного раствора ацетата свинца и по каплям 10%-ный раствор гидроксида натрия до растворения первоначально образующегося осадка. Добавляют 5 капель исследуемого раствора, кипятят и дают постоять 1 2 минуты. При стоянии появляется бурый иличерныйосадоксульфида свинца.

Метионин, хотя и является содержащей серу аминокислотой, этой реакции не дает, поскольку сера в нем связана прочно.

Указания к составлению отчета: В отчете отразить резуль-

таты всех цветных реакций, написать химизм каждой цветной реакции, сделать вывод о присутствии функциональных групп в исследуемом растворе белка.

Лабораторная работа № 6 КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА

Цель работы: освоить метод количественного определения белка в биологическом материале и научиться использовать стандартные тест-системы.

Для количественного определения белков в биологическом материале чаще всего используются азотометрия, фотоколориметрия и спектрофотометрия.

Азотометрия основана на определении содержания азота белка после минерализации исследуемого образца. К азотометрии относится классический метод Кьельдаля и его модификации. Эти методы очень трудоемки и не всегда надежны, так как содержание азота в разных белках колеблется от 14 до 19 %.

Фотоколориметрические методы основаны на цветных реакциях на функциональные группы белков. Среди них наибольшее применение нашли биуретовая реакция на пептидные группы и реакция Фолина на ароматические радикалы аминокислот. Биуретовый метод является более специфичным, так как ему не мешают примеси – свободные аминокислоты и фенольные соединения. После проведения цветнойреакции на белокпо светопоглощению окрашенногораствора в монохроматическом свете определяют содержаниебелка.

24

Также существует прямой спектрофотометрический метод определения содержания белка, который состоит в измерении светопоглощения раствора белка в УФ-области спектра при 200 220 нм (пептидные группы белка) и при 280 нм (ароматические радикалы аминокислот). Этот метод весьма удобен и не требует предварительного образования окрашенных комплексов, но требует специальное оборудование (УФ-спектрофотометр).

Для рутинных исследований в биологических и медицинских лабораториях часто пользуются стандартизированными наборами реагентов, так как работа с ними значительно сокращает время анализа (за счет сокращения времени на подготовку реактивов), существенно повышает правильность определения концентраций и упрощает расчетную часть за счет использования метода стандарта. Применительно к нашей задаче существуют наборы для определения концентрации общего белка в сыворотке и плазме крови биуретовым методом (например, Total Protein FL-E отечественного производителя «Витал Диагностикс СПб»).

Метод основан на способности белка образовывать окрашенный комплекс с ионами меди в щелочной среде, интенсивность окраски которогопропорциональнасодержаниюбелкависследуемомматериале.

Исследуемый материал: водный раствор белка.

Реактивы: набор для определения концентрации общего белка в сыворотке и плазме крови биуретовым методом (Total Protein FL-E «Витал Диагностикс СПб» или аналогичный), вкоторый входит:

1.Концентрат биуретового реактива, содержащий гидроксид натрия 0,5 моль/л; калий-натрий виннокислый 80 ммоль/л; калий йодистый 75 ммоль/л; сульфат меди 30 ммоль/л. Концентрат стабилен в темноте при комнатной температуре. Перед проведением анализа необходимое количество концентрата разводят в 5 раз (1 часть концентрата + 4 части дистиллированной воды).

2.Стандарт, содержащий альбумин сывороточный 70 г/л, натрий хлористый 154 ммоль/л. Стабилен не менее года при комнатной температуре.

Оборудование:

1.Фотоэлектроколориметр.

25

2.Штатив с пробирками.

3.Пипетки на 5 мл и 100 мкл.

Ход работы: Взять три пробирки. В первую пробирку (опыт) поместить 5 мл биуретового реактива и 100 мкл исследуемого раствора белка. Во вторую пробирку (стандарт) поместить 5 мл биуретового реактива и 100 мкл стандарта. В третью пробирку (контроль) поместить 5 мл биуретового реактива и 100 мкл дистиллированной воды. Содержимое пробирок перемешивают, выдерживают при комнатной температуре30 минут.

Содержимое опытной и стандартной пробирок фотометрируют против контроля при длине волны 540 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см.

Указания к составлению отчета: Концентрацию общего белка

(г/л) рассчитывают по формуле

С = (Еопыт/Естандарт) · 70,

где Еопыт, Естандарт – соответственно оптические плотности исследуемого (опыт) и стандартного (стандарт) растворов белка после

проведения биуретовой реакции; 70 – концентрация белка в стандартном растворе, г/л.

Вопросы для самостоятельной работы к разделу «Аминокислоты и белки»

1.На чем основано хроматографическое разделение аминокислот?

2.Почемудляхроматографиииспользуетсясмесьрастворителей?

3.На чем основана классификация цветных реакций?

4.Какую из цветных реакций лучше всего использовать для определения концентрации белка? Почему?

5.На чем основана нингидриновая реакция?

6.Где на практике применяют цветные реакции на белки?

7.Что такое коэффициент Rf?

8.Как связаны между собой остатки аминокислот в молекуле

белка?

9.Почему для проведения биуретовой реакции нужна щелочная среда?

26

10.Будет ли протекать нингидриновая реакция с β-аланином?

11.Какие серосодержащие аминокислоты вы знаете?

12.В чем преимущество определения концентрации веществ по стандарту над определением по калибровочному графику?

13.Что такое кислый, основной и нейтральный белок? Приведите примеры аминокислот, определяющих эти свойства белков.

14.Белок куриного яйца содержит в своем составе в основном моноаминодикарбоновые аминокислоты. Какой заряд имеет молекула такого белка? Какова реакция среды в растворе яичного белка? При какихусловиях этот белокдостигаетизоэлектрическойточки?

15.Как объяснить, что белок молока казеин при кипячении сворачивается(выпадает восадок), еслимолоко кислое.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.Строев Е.А., Макарова В.Г., Матвеева И.В. Практикум по биологической химии / Мед. информ. агентство. – М., 2012. – 384 с.

2.Зубаиров Д.М., Тимербаев В.Н., Давыдов В.С. Руководство

клабораторным занятиям по биологической химии: учеб. пособие.

М.: Гэотар-Медиа, 2005. – 392 с.

3.Дзантиев Б.Б., Жердев А.В. Биохимические методы анали-

за. М.: Наука, 2010. – 392 с.

4.Меньшиков В.В. Методики клинических лабораторных исследований. Справочное пособие. М.: Лабора, 2009. – 880 с.

5.Коваленко Л.В. Биохимические основы химии биологиче-

ски активных веществ: учеб. пособие. М.: Бином. Лаборатория знаний, 2012. – 229 с.

6.Носова Э.В. Химия гетероциклических биологически активных веществ: учеб. пособие. Екатеринбург: Изд-во Урал. фе-

дер. ун-та, 2014. – 204 с.

7.Чиркин А.А. Практикум по биохимии. – Минск: Новое зна-

ние, 2002. – 512 с.

8.Кушманова О.Д., Ивченко Г.М. Руководство к практическим занятиям побиологическойхимии. – М.: Медицина, 1974. – 424 с.

27

Учебное издание

БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА В БИОТЕХНОЛОГИИ

Методические указания к лабораторным работам

Составители:

Д.А. Казаков, Л.С. Пан, Л.В. Аникина, А.В. Портнова, Г.А. Козлова

Корректор В.В. Мальцева

Подписано в печать 14.04.2016. Формат 60 90/16. Усл. печ. л. 2,0. Тираж 100 экз. Заказ № 50/2016.

Издательство Пермского национального исследовательского

политехнического университета.

Адрес: 614990, г. Пермь, Комсомольский пр., 29, к. 113.

Тел. (342) 219-80-33.

28