Биологически активные вещества в биотехнологии

Министерство образования и науки Российской Федерации

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пермский национальный исследовательский политехнический университет»

Кафедра химии и биотехнологии

БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА В БИОТЕХНОЛОГИИ

Методические указания к лабораторным работам

Издательство Пермского национального исследовательского

политехнического университета

2016

1

Составители: Д.А. Казаков, Л.С. Пан, Л.В. Аникина, А.В. Портнова, Г.А. Козлова

УДК 577.19 (076.5) Б63

Рецензент канд. хим. наук, доцент М.М. Соколова

(Пермский национальный исследовательский политехнический университет)

Биологически активные вещества в биотехнологии : Б63 метод. указания к лабораторным работам / сост. Д.А. Казаков, Л.С. Пан, Л.В. Аникина, А.В. Портнова, Г.А. Козлова. – Пермь :

Изд-во Перм. нац. исслед. политехн. ун-та, 2016. 28 с.

Составлены в соответствии с федеральным государственным образовательным стандартом по направлению подготовки 19.03.01 «Биотехнология», рабочей программой дисциплины «Химия биологически активных веществ». Для каждой лабораторной работы дан перечень оборудования, реактивов, описаны методики проведения опытов и расчетов. Каждый раздел содержит вопросы для самостоятельной работы по теме.

Предназначены для студентов очной формы обучения по направлению 19.03.01 «Биотехнология».

© ПНИПУ, 2016

2

ВВЕДЕНИЕ

В результате интенсивного развития химии биологически активных веществ в последние годы получены новые знания, сделавшие возможным практическое использование ранее неизвестных или малоизвестных соединений различных классов, нашедших применение в биотехнологии, медицине, косметике, сельском хозяйстве, пищевой промышленности и других отраслях. Промышленное освоение получения биологически активных соединений привело к разработке новейших технологий, объединенных общим названием «биотехнология».

Лабораторные работы проводятся с целью приобретения навыков и умений выделения биологических активных веществ из биологического материала, исследования их структуры и химических свойств с использованием необходимых реактивов и оборудования. Проведение лабораторных работ по химии биологически активных веществ позволяет закрепить теоретические знания о строении, пространственной структуре, биологических функциях и основах функционирования белков, нуклеиновых кислот, углеводов, липидов, низкомолекулярных биорегуляторов и продуктов жизнедеятельности клеток.

ТЕХНИКА БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ РАБОТЕ

ВБИОХИМИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ

Влаборатории нужно соблюдать следующиеобщиетребования: 1. Работать только в спецодежде – халате и сменной обуви. 2. Приступать к работе только после вводного инструктажа и

первичного инструктажа на рабочем месте. Повторный инструктаж проводится не реже одного раза в шесть месяцев.

3.Перед работой внимательно ознакомиться с методикой проведения анализа и в соответствии с этим подготовить свое рабочее место.

4.Перед работой следует убедиться в том, что:

правильно уяснена методика;

4

правильно подготовлены приборы и оборудование;

взятые вещества соответствуют методике анализа;

всё расставлено так, чтобы было удобно достать, не вставая с места, и самое необходимое находится в пределах оптимальной рабочейзоны, соответствующейразмахусогнутойвлоктевомсуставеруки.

5.Работать только на своем месте.

6.Рабочее место содержать в чистоте, не загромождать его ненужными предметами.

7.Во время работы соблюдать тишину, порядок и чистоту.

8.Не допускать торопливости, невнимательности, беспорядочности и неряшливости.

9.Не покидать рабочее место во время проведения анализа, не оставлять без присмотра включенные приборы.

10.Запрещается выполнять работы, не связанные с непосредственной работой в лаборатории.

11.Соблюдать правила техники безопасности при работе с кислотами, щелочами, летучими и ядовитыми веществами, нагревательными приборами.

12.Соблюдать правила противопожарной безопасности.

13.Не наклоняться близко над открытыми склянками с реак-

тивами.

14.Работать с реактивами только над столом.

15.Пипетировать вещества только пипеткой с грушей или дозатором.

16.Запрещено выливать вещества в канализацию, для этого предусмотрены специальные банки.

17.Не пробовать на вкус в лаборатории любые вещества, даже если они кажутся вам знакомыми.

18.В лаборатории запрещается принимать пищу.

19.После работы обязательно вымыть руки с мылом.

20.После работы убрать все реактивы по местам, выключить все электроприборы, закрыть форточки, краны водоснабжения и протереть рабочий стол.

5

ТРЕБОВАНИЯ К ОФОРМЛЕНИЮ ОТЧЕТОВ ПО ЛАБОРАТОРНЫМ РАБОТАМ

Лабораторные работы оформляются каждым студентом в отдельной тетради согласно следующему плану:

1.Дата.

2.Название лабораторной работы.

3.Цель работы.

4.Принцип выделения, идентификации и количественного определения биомолекул, формулы и химизм реакций.

5.Методика выполнения работы.

6.Наблюдаемые явления и расчеты.

7.Выводы по работе с объяснением полученных результатов. В конце каждого раздела даются вопросы для самостоятельной

работы, которыепомогутприподготовкекзащителабораторныхработ.

РАЗДЕЛ I. УГЛЕВОДЫ, ЛИПИДЫ, НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ БИОРЕГУЛЯТОРЫ

Лабораторная работа № 1 КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ УГЛЕВОДОВ В РАСТИТЕЛЬНОЙ БИОМАССЕ

Цель работы: овладеть методами количественного определения содержания углеводов в растительном сырье.

В различных сортах яблок содержание углеводов может изменяться в диапазоне 6 148 мг/г с преобладанием отдельных моносахаридов, а также сахарозы.

Исследуемый материал: яблоки нескольких сортов.

Реактивы:

1.0,1 н раствор йода.

2.0,1 н раствор натрия гидроксида.

3.10%-ный раствор серной кислоты.

4.0,1 н раствор натрия тиосульфата.

5.1%-ный раствор крахмала.

6.10%-ный раствор соляной кислоты.

7.Сода.

6

Оборудование:

1.Плоскодонные колбы на 100 мл.

2.Водяная баня с термометром.

3.Воронки.

4.Фильтры бумажные.

5.Мерные колбы на 100 мл.

6.Пипетка на 5 мл.

7.Индикаторная бумага.

8.Мерные колбы на 50 мл.

Ход работы: Берут навеску 5 г одного из сортов яблок, прибавляют 50 мл дистиллированной воды и экстрагируют на водяной бане при температуре 70 °С в течение 30 минут. Температуру бани не доводят до 100 °С, чтобы избежать гидролиза сахарозы, который может идти под влиянием имеющихся в яблоках кислот. По истечении времени нагревания вытяжку отфильтровывают через складчатый фильтр в мерную колбу на 100 мл. Остаток на фильтре несколько раз промывают горячей водой. Охлажденную до комнатной температуры вытяжку с промывными водами доводят водой до метки. Отбирают пипеткой 5 мл вытяжки и определяют в ней содержание глюкозы по Вильштеттеру. Метод определения основан на окислении альдегидной группы глюкозы йодом до карбоксильной группы в присутствии фруктозы и сахарозы, которые остаются неизменными.

Для определения глюкозы по Вильштеттеру к 5 мл исследуемого раствора прибавляют 7 мл 0,1 н раствора йода. Через 2 3 минуты при энергичном перемешивании медленно добавляют 10 мл 0,1 н раствора натрия гидроксида и оставляют стоять на 20 минут в темном месте. После этого раствор подкисляют 10%-ным раствором серной кислоты до кислой рН и остаток йода титруют 0,1 н раство-

7

ром натрия тиосульфата в присутствии индикатора – раствора крахмала. Титрование проводят как минимум в трех повторностях.

Далее 25 мл вытяжки из яблок помещают в коническую колбу, прибавляют 2 мл 10%-ной соляной кислоты и смесь выдерживают на кипящей водяной бане в течение 30 минут, затем раствор охлаждают, доводят до нейтральной рН с помощью соды, переливают в мерную колбу на 50 мл и доводят водой до метки. Далее снова определяют глюкозу по методу Вильштеттера. В этом случае будет определена суммарно свободная глюкоза и глюкоза, образовавшаяся при гидролизе сахарозы.

Указания к составлению отчета: Содержание свободной глюкозы в яблоке (мг/г) рассчитывают по результатам первого титрования (до гидролиза сахарозы) по формуле

Q1 = T·(V1 – V2)·k1/m,

где Т – титр 0,1 н раствора йода по глюкозе, равный 9 мг/мл; V1 – объем 0,1 н раствора йода, добавленный в аликвоту исследуемой вытяжки до гидролиза сахарозы, мл; V2 – объем 0,1 н раствора тиосульфата натрия, пошедший на титрование вытяжки до гидролиза сахарозы, мл; k1 – коэффициент пересчета, учитывающий соотношение объемов аликвоты вытяжки, взятой на анализ, и ее общего объема (k1 = 20); m – масса навески яблока, г.

Содержание сахарозы в яблоке (мг/г) рассчитывают совместно по результатам первого (до гидролиза сахарозы) и второго титрований (после гидролиза сахарозы) по формуле

Q2 = (T·(V3 – V4)·k2 – Q1)·Mс/(m·Мг),

где V3 – объем 0,1 н раствора йода, добавленный в аликвоту вытяжки, полученной после гидролиза сахарозы, мл; V4 – объем 0,1 н раствора тиосульфата натрия, пошедший на титрование вытяжки, полученной после гидролиза сахарозы, мл; k2 – коэффициент пересчета, учитывающий соотношение объемов аликвоты вытяжки, взятой на анализ, ее общего объема и разведение, произведенное на стадии гидролиза сахарозы; Mс, Мг – соответственно молярные массы сахарозы и глюкозы, г/моль.

Напишите уравнение реакции гидролиза сахарозы.

8

Лабораторная работа № 2 КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА АНТИБИОТИКИ

Цель работы: формирование навыков анализа различных групп антибиотиков.

Исследуемый материал: порошки эритромицина, тетрациклина и левомицетина.

Реактивы:

1.Концентрированная серная кислота.

2.5%-ный раствор FeCl3.

3.10%-ный раствор NaOH.

Оборудование:

1.Штатив с пробирками.

2.Пипетки.

Ход работы:

1.Качественная реакция на эритромицин. Эритромицин

относится к группе антибиотиков-макролидов, содержащих в молекуле макроциклическое лактонное кольцо. Продуцируется акти-

номицетами Streptomyces erythreus.

OHOHOO O

эритромицин

Метод основан на образовании окрашенных продуктов окисления под действием концентрированных кислот.

9

К 0,02 г эритромицина добавить 2 мл концентрированной серной кислоты, появляется красно-коричневое окрашивание.

2. Качественные реакции на тетрациклин. Тетрациклины – группа антибиотиков, имеющая конденсированную четырехциклическую систему под общим названием тетрациклин. Тетрациклины были выделены из актиномицетов Streptomyces aureoaciens и Streptomyces rimosus. В основе действия тетрациклинов лежит подавление ими биосинтеза белка микробной клетки на уровне рибосом.

тетрациклин

Метод основан на свойстве концентрированной серной кислоты образовывать ангидропроизводные тетрациклинов. При последующем добавлении хлорида железа проявляется окраска, обусловленная наличием фенольных гидроксилов в молекуле тетрациклина.

0,1 г тетрациклина поместить в пробирку, прибавить 2 мл концентрированной серной кислоты. При добавлении 1 мл воды окраска становится фиолетовой в случае тетрациклина, красной в случае окситетрациклина и зеленой в случае хлортетрациклина. При добавлении 1 2 капель раствора хлорида железа окраска переходит в коричневую или красно-коричневую.

3. Качественная реакция на левомицетин. Левомицетин – синтетическое вещество, идентичное природному антибиотику хлорамфениколу, являющемуся продуктом жизнедеятельности актиномицетов Streptomyces venezuelae. Механизм антимикробного действия связан с нарушением синтеза белков микроорганизмов.

10