Добавил:
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:

Аналитические методы в биохимии и биотехнологии

..pdf
Скачиваний:
11
Добавлен:
15.11.2022
Размер:
496.15 Кб
Скачать

Министерство образования и науки Российской Федерации

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования

«Пермский национальный исследовательский политехнический университет» Кафедра химии и биотехнологии

Л.Д. Аснин, Д.А. Казаков

АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В БИОХИМИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ

Утверждено Редакционно-издательским советом университета

в качестве учебно-методического пособия

Издательство Пермского национального исследовательского

политехнического университета

2016

УДК 543.64(076) А90

Рецензенты:

канд. хим. наук, доцент Л.С. Пан (Пермский национальный исследовательский политехнический университет);

канд. хим. наук, доцент М.Г. Щербань (Пермский государственный национальный исследовательский университет)

Аснин, Л.Д.

А90 Аналитические методы в биохимии и биотехнологии : учеб.- метод. пособие / Л.Д. Аснин, Д.А. Казаков. – Пермь : Изд-во Перм. нац. исслед. политехн. ун-та, 2016. – 44 с.

ISBN 978-5-398-01665-9

Изложены методы анализа биополимеров и биологически активных соединений, применяемые в исследовательских и промышленных биохимических лабораториях. Приведены задания для практических работ, включенных в рабочую программу дисциплины «Аналитические методы в биохимии», а также примеры их выполнения.

Предназначено для студентов очной формы обучения по направлению подготовки 19.04.01 «Биотехнология».

УДК 543.64(076)

ISBN 978-5-398-01665-9

©ПНИПУ, 2016

ОГЛАВЛЕНИЕ

 

Введение..........................................................................................

4

Практическая работа № 1. Оценка погрешностей

 

результатов измерений...................................................................

4

Практическая работа № 2. Использование программного

 

пакета Microsoft Excel для статистического анализа

 

результатов измерений...................................................................

9

Практическая работа № 3. Полярографический анализ...........

15

Практическаяработа № 4. Спектрофотометрический анализ.....

19

Практическая работа № 5. Интерпретация масс-спектров.......

22

Практическая работа № 6. Характеристики элюирования

 

и разделения в хроматографии...................................................

27

Практическая работа № 7. Гель-фильтрационная

 

хроматография..............................................................................

32

Практическая работа № 8. Гель-электрофорез..........................

35

Список рекомендуемой литературы...........................................

39

Приложение А...............................................................................

40

Приложение Б...............................................................................

41

Приложение В...............................................................................

42

Приложение Г...............................................................................

43

3

ВВЕДЕНИЕ

Пособие составлено в соответствии с государственным образовательным стандартом по направлению подготовки 19.04.01 «Биотехнология» (уровень магистратуры).

Практические занятия по дисциплине «Аналитические методы в биохимии» проводятся с целью освоения студентами способов выполнения типовых расчетов в различных методах инструментального анализа и приобретения навыков анализа результатов измерений. Также проведение практических занятий позволяет подтвердить теоретические положения и выводы по отдельным вопросам дисциплины и тем самым закрепить знания о методах анализа биологических образцов.

Практические работы оформляются каждым студентом в отдельной тетради с указанием даты выполнения. Отчет о проведенной работе должен включать в себя: тему практического занятия, краткое описание задания, ход решения и ответ.

Вприложениях приведена необходимая для расчетов справочная информация.

Вконце каждой работы даются контрольные вопросы, которые помогут при подготовке практической работы к защите.

Практическая работа № 1 ОЦЕНКА ПОГРЕШНОСТЕЙ РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЙ

Цель работы: освоить методы расчета погрешности измерений.

Теоретическое введение

Под погрешностью измерения понимают разность между измеренным значением величины и ее действительным значением. Она включает две составляющих: случайную погрешность измерений, изменяющуюся случайным образом (по знаку и величине) при повторных измерениях, и систематическую погрешность, которая оста-

4

ется постоянной или закономерно изменяется при повторных измерениях одной и той же величины.

Если систематическая погрешность известна, то результаты измерений могут быть соответствующим образом скорректированы. Однако не всегда и не все составляющие систематической погрешности известны. Та часть систематической погрешности, которая не может быть исключена, называется неисключенной систематической погрешностью

(НСП).

Оценкой определяемой величины по серии повторяющихся измерений служит среднее арифметическое значение x результатов измерений, вычисляемое по формуле

x

1 n

xi ,

(1.1)

 

n i 1

 

 

где xi – результат i-го измерения; n – число измерений.

Разброс результатов измерений характеризуют величиной среднего квадратического отклонения (СКО) S случайной величины:

n xi x 2

S

i 1

 

.

(1.2)

 

n 1

 

 

 

 

Оценкой случайной погрешности среднего значения служит величина СКО среднего арифметического значения, рассчитываемая по формуле

Sx

S

.

(1.3)

 

 

n

 

Доверительные границы случайной погрешности характеризуют возможное отклонение измеряемой величины от среднего значения с заданной доверительной вероятностью Р и рассчитываются следующим образом:

P tP,n Sx ,

(1.4)

где tP,n – коэффициент Стьюдента. Его значения для заданной доверительной вероятности и числа измерений находят по таблице, приведенной в прил. А.

5

Оценка доверительных границ неисключенной систематической погрешности зависит от числа составляющих систематической погрешности. В простейшем случае, если это число меньше 3, граница НСП Θ определяется как сумма абсолютных величин составляющих этой погрешности. Такими составляющими могут быть систематические погрешности средства измерения и методики измерения. Систематические погрешности средств измерений приводятся в паспорте на средство измерения; систематические погрешности методики измерения могут быть указаны в описании методики или должны определяться в специальных экспериментах.

Среднее квадратическое отклонение НСП связано с Θ следующим выражением:

S

 

.

(1.5)

3

 

 

 

Суммарные доверительные границы погрешности оценки измеряемой величины согласно ГОСТ Р 8.736–2011 находят по формуле

 

 

= KSΣ,

(1.6)

где S

– суммарное СКО, S

Sx2 S 2 ;

K – коэффициент, учиты-

вающий соотношение вкладов случайной и систематической погрешностей,

K

P

.

(1.7)

 

 

Sx S

 

Результат измерения записывают следующим образом:

 

x x , P.

(1.8)

Число значащих цифр при указании погрешности не должно быть больше двух. Числовое значение оценки результата измерения должно оканчиваться на цифру того же разряда, что и у значения погрешности.

Пример 1.1. Для определения рН культуральной жидкости были отобраны три пробы, и в каждой из них была измерена величина рН. Получены следующие результаты: 5,01; 4,85; 5,05. Систематическая

6

погрешность рН-метра составляет 0,02 ед. рН. Рассчитайте доверительные границы случайной погрешности измерений для доверительной вероятности 0,95 и суммарные доверительные границы погрешности измерений, приведите результат измерения рН с указанием доверительных границ.

Решение. Рассчитаем среднее значение измеряемой величины по формуле (1.1), СКО случайной величины по формуле (1.2) и СКО среднего значения по формуле (1.3). Для удобства вычислений результаты будем заносить в табл. 1.1. Промежуточные вычисления будем проводить с точностью до 4 значащих цифр.

Таблица 1.1

Вычисление среднего значения и СКО рН культуральной жидкости

Величина

Значение

xi x

xi x 2

Результаты

 

 

 

 

расчетов

х1

5,01

0,04

0,0016

x 4,97

х2

4,85

–0,12

0,0144

S = 0,1058

х3

5,05

0,08

0,0064

Sx 0,0611

Сумма

14,91

 

0,0224

 

Для Р = 0,95 и n = 3 по таблице в прил. А находим значение коэффициента Стьюдента: t0,95; 3 = 4,3. Подставляя его в уравнение (1.4),

получим: 0,95 = 4,3·0,0611 = 0,2627.

За НСП примем погрешность средства измерения. Соответствующее значение СКО оценим по формуле (1.5): S 0,02 3 =

= 0,0115. Далее вычисляем суммарное СКО погрешности измеряемой величины:

S

Sx2 S 2

 

0,06112 0,01152

0,0622.

Коэффициент K, необходимый для расчета , вычисляем по формуле (1.7):

7

K 0,2627 0,02 3,894. 0,0611 0,0115

Витоге по уравнению (1.6) находим доверительные границы измеряемой величины: = 3,894 · 0,0622 = 0,2422.

Вответе приводим значения погрешностей, округленные до двух значащих цифр.

Ответ: рН = 4,97 ± 0,24, Р = 0,95; 0,95 = 0,26.

Задания для практической работы

Задание 1.1. Определение общего содержания белков в порошковом молоке дало следующие результаты в трех параллельных измерениях: 80,9; 79,8; 80,5 %. Вычислите содержание белков и представьте результат с указанием доверительных границ для Р = 0,95. Систематической погрешностью измерений пренебречь.

Задание 1.2. При определении общего содержания полифенолов в красном перце методом Фолина–Чокальтеу получены следующие результаты: 0,154; 0,121; 0,133 г/100 г. Известно, что относительная систематическая погрешность методики измерения составляет 1%. Рассчитайте средний результат измерений и представьте его с указанием доверительных интервалов.

Задание 1.3. В титриметрии систематическая погрешность равна половине цены деления бюретки (SΘ = 0,05 мл); случайная погрешность единичного измерения, выраженная через СКО, обычно составляет величину порядка одной цены деления (S = 0,1 мл). При увеличении числа параллельных измерений случайная погрешность

уменьшается обратно пропорционально n .

Таблица 1.2

Результаты расчетов

n

SΘ, мл

Sx , мл

SΣ, мл

Относительная

разность, %

 

 

 

 

1

2

3

8

Окончание табл. 1.2

n

SΘ, мл

Sx , мл

SΣ, мл

Относительная

разность, %

 

 

 

 

4

5

6

Выясните, как будут изменяться вклады случайной и систематической погрешности в суммарную погрешность измерения, выраженную через суммарное СКО. Результаты представьте в виде табл. 1.2. При каком числе экспериментов дальнейшее их увеличение не будет давать прироста точности более 10 %?

Контрольные вопросы

1.Чем отличается СКО случайной величины от СКО среднего значения?

2.Зависят ли от величины доверительной вероятности результат измерения, доверительныеграницыпогрешностиизмеряемойвеличины?

3.Что такое неисключенная систематическая погрешность?

4.Как округляется значение результата измерений? Почему?

Практическая работа № 2 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПРОГРАММНОГО ПАКЕТА MICROSOFT EXCEL ДЛЯ СТАТИСТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЙ

Цель работы: освоить инструменты программного пакета MS Excel для выполнения простых статистических расчетов, линейного и нелинейного регрессионного анализа.

Теоретическое введение

Программный пакет MS Excel включает встроенные функции и макросы для статистического анализа данных. Функции Excel

9

имеют общий синтаксис ФУНКЦИЯ(Аргумент 1; Аргумент 2;…; Аргумент N). Аргументами могут быть как одно число (одна ячейка), так и диапазон значений (диапазон ячеек). Набор функций, используемых для вычисления статистических характеристик результатов многократных измерений, приведен в табл. 2.1.

 

 

Таблица 2.1

Статистические функции Excel

 

 

 

Характеристика

Номер

Формат функции

формулы

 

 

 

Описательная статистика

Среднее арифметическое

(1.1)

СРЗНАЧ(Диапазон_х)

Среднее квадратическое

(1.2)

СТАНДОТКЛОН(Диапазон_х)

отклонение

 

 

Доверительные границы

(1.4)

ДОВЕРИТ.СТЬЮДЕНТ(1-Р, Sx ,n)*

случайной погрешности

 

 

 

Линейная

регрессия

Коэффициент корреляции

(2.2)

КОРРЕЛ(Диапазон_у; Диапазон_х)

Наклон линейной

(2.3)

НАКЛОН(Диапазон_у; Диапазон_х)

зависимости

 

 

Свободный член линейной

(2.4)

ОТРЕЗОК(Диапазон_у; Диапазон_х)

зависимости

 

 

* В Excel 2010 и выше.

Линейный регрессионный анализ. Задачей линейного регресси-

онного анализа является определение параметров линейной зависимости, представленной в общем виде уравнением

y = a + bx,

(2.1)

где у – зависимая переменная; х – независимая (влияющая) переменная; a – свободный член; b – наклон.

О наличии линейной связи между влияющей и зависимой переменными можно судить по графику (представляя экспериментальные данные в графическом виде) или по значению коэффициента корреляции r, рассчитываемого по формуле

10