Основы клеточной и генетической инженерии (90

В современной научной литературе животных, полученных при партеногенезе, называют партеногенами. В 1886 г. русским биологом Л. А. Тихомировым было открыто явление искусственного партеногенеза тутового шелкопряда. Впервые он экспериментально доказал, что неоплодотворенная яйцеклетка тутового шелкопряда может быть активирована к развитию искусственными стимулами, в частности, разведенной серной кислотой. Это открытие послужило отправной точкой для изучения проблемы партеногенеза. Шелкопряд оказался наиболее удачным объектом для изучения и практического использования партеногенеза.

Естественный партеногенез. Естественный партеногенез наиболее распространен у насекомых — палочников, жуков-долгоносиков, а также у ракообразных и коловраток. Он обнаружен также у пчел (трутни), ос, скальной ящерицы. Среди домашних животных естественный партеногенез выявлен у индеек. Было замечено, что из неоплодотворенных яиц белтсвиллских мелких белых индеек в некоторых случаях (1-4%) могут развиваться эмбрионы. Селекция на повышение частоты естественного партеногенеза оказалась эффективной. В результате целенаправленной селекции доля партеногенетически развивающихся яиц достигла 42 %. Было отмечено, что при отсутствии отбора лишь в единичных случаях партеногенетическое развитие проходит до вылупления птенцов-партеногенов.

При проведении селекции процент эмбрионов, развивающихся до поздних стадий инкубации, возрастает. Следует отметить, что все партеногенетические эмбрионы и сформировавшиеся из них индюшата были самцами. Цитогенетический анализ показал, что партеногены имели диплоидный набор хромосом. С точки зрения генетики получение партеногенетических самцов можно объяснить следующим образом. У индеек женский пол гетерогаметен (ZW). Поэтому самка имеет половину ооцитов с Z-половой хромосомой, а половину - с W-половой хромосомой. При партеногенетическом развитии яиц происходит удвоение хромосом в ооцитах, содержащих Z-хромосому, что приводит к образованию зиготы ZZ, из которой и образуются жизнеспособные

31

самцы с нормальным для них набором половых хромосом. При удвоении хромосом типа W образуются зиготы, а затем и эмбрионы с набором хромосом WW, т. е. лишенные Z-хромосомы. Такие особи являются нежизнеспособными. Надо подчеркнуть роль селекции в создании партеногенетических животных и линий. В упомянутой породе индеек в результате партеногенетического развития из оплодотворенного яйца был получен диплоидный индюк, который стал отцом 122 нормальных индюшат. Однако спонтанный партеногенез является лишь исключением в размножении животных. Даже в приведенном случае с индюками естественный партеногенез нельзя рассматривать как нормальный половой процесс.

Искусственный партеногенез. На базе современной биотехнологии могут быть разработаны эффективные методы, вызывающие искусственный партеногенез путем стимуляции партеногенетического развития яйцеклетки. Большие успехи в этом направлении достигнуты, как указывалось, у домашнего шелкопряда. В отличие от других видов животных яйцеклетки тутового шелкопряда оказались более доступными для активации к партеногенетическому развитию.

Наибольший интерес вызывает индуцированный партеногенез у млекопитающих. Однако у этого класса животных вызывание индуцированного партеногенеза из-за особенностей оогенеза связано с большими трудностями. Дело в том, что у млекопитающих, как правило, яйцеклетки овулируют на стадии метафазы II. Поэтому партеногенетическому развитию могут быть подвергнуты лишь зрелые ооциты. Лишь в 70-е годы с разработкой методов культивирования и оплодотворения фолликулярных ооцитов in vitro начались широкие исследования по стимуляции партеногенеза у млекопитающих, в том числе у крупного рогатого скота. В качестве стимуляторов, вызывающих партеногенетическое развитие яйцеклетки, используют механические, физические, химические и биологические факторы.

32

Первые опыты по изучению индуцированного партеногенеза млекопитающих были проведены еще в 30-е годы. Так, Г. Пинкус в 1939 г. опубликовал работу, в которой описал партеногенетическое развитие у яйцеклеток кролика. В качестве стимулирующего агента им был использован температурный шок. Автор указывает, что партеногенетическое развитие происходило в основном на ранних стадиях эмбриогенеза. Однако отдельные партеногенетические зародыши развивались до конца беременности самки.

В 70-х годах были разработаны новые методы активации яйцеклеток к партеногенетическому развитию у мышей. Характерными особенностями методов явились хорошая воспроизводимость результатов экспериментов, а также возможность воздействия на ооциты в материнском организме или на изолированные, культивируемые in vitro.

Задание: изучить и освоить методы клонирования млекопитающих, ответить на вопросы.

Задание №1: зарисовать схему клонирования на примере овечки.

Задание №2: изучить и записать основные этапы клонирования эмбрионов путём пересадки ядра в энуклеированную яйцеклетку.

Задание №3: отметить отличительные особенности методов клонирования. Задание выполнить по форме таблицы №5, наличие или отсутствие тех или иных особенностей отмечать знаками « + », « - ».

Таблица 5- Отличительные особенности разновидностей клонирования

Домашнее задание: используя материалы рекомендуемых интернет-сайтов привести

примеры получения клонированных животных с целью коммерческой выгоды.

33

СЛОВАРЬ ТЕРМИНОВ

Аденин – пуриновое основание, комплементарное тимину и урацилу. Одно из азотистых оснований, входящих в состав ДНК и РНК.

Аминокислота – мономерная единица («строительный блок») белковых молекул.

Анаэробные микроорганизмы – микроорганизмы, растущие в отсутствие кислорода.

Антибиотик – вещество, синтезируемое одним микроорганизмом и оказывающее ингибирующее действие на другие микроорганизмы и раковые клетки.

Антиген – вещество, воспринимаемое организмом как чужеродное и вызывающее специфический иммунный ответ – выработку антител.

Антикодон – триплет нуклеотидов в молекуле тРНК, комплементарный нуклеотидам специфического кодона в молекуле мРНК.

Антитело – белок (иммуноглобулин), синтезируемый В-лимфоцитами в ответ на попадание в организм различных антигенов и специфически с ним взаимодействующий.

Аутосома – любая хромосома, не являющаяся половой.

Аэробные микроорганизмы – микроорганизмы, растущие только в присутствии кислорода.

Бактериофаг (фаг) – вирус, инфицирующий бактерии.

Биомасса – клеточная масса, образующаяся в результате жизнедеятельности живых организмов.

Брешь, пробел – отсутствие одного или нескольких нуклеотидов в одной из из цепей двухцепочной ДНК.

Вектор – самореплицирующаяся молекула ДНК, используемая в генной инженерии для переноса генов от организма-донора в организм-реципиент, а также для клонирования нуклеотидных последовательностей.

Вставка – сегмент ДНК, встроенный в клонирующий вектор.

Гамета – репродуктивная гаплоидная клетка многоклеточного организма.

34

Клон – популяция клеток или молекул, идентичных одной родоначальной клетке или молекуле.

Клонирование – совокупность процедур, использующихся для получения клонов. Клонирование многоклеточных организмов, например, включает пересадку ядер соматических клеток в оплодотворенное яйцо с удаленным пронуклеусом.

Клонирование генов – система методов, использующаяся для получения клонированных ДНК: выделение нужного гена из какого-либо организма, встраивание его в плазмиду (вектор), введение в клетку организма-хозяина, многократная репликация.

Клонирующий вектор – молекула ДНК (плазмидная или вирусная ДНК), предназначенная для клонирования ДНК-мишени.

Космида – вектор, объединяющий свойства плазмидного вектора и вектора на основе фага λ. Имеет cos-сайты.

Кофактор – низкомолекулярное вещество, необходимое для протекания определенной ферментативной реакции.

Коферментация – одновременный рост двух микроорганизмов в одном биореакторе.

Культура – популяция клеток или микроорганизмов, выращиваемых в контролируемых условиях in vitro.

Лигирование – соединение двух молекул ДНК с помощью фосфодиэфирных связей. In vitro катализируется ферментом ДНК-лигазой фага Т4.

Лизис – разрушение клеточных стенок под действием ферментов, содержащихся в лизосомах, или других агентов.

Липаза – фермент, расщепляющий липиды.

Липкие концы – взаимно комплементарные одноцепочные участки ДНК, выступающие по концам двухцепочечной молекулы; образуются в результате ступенчатых разрезов двухцепочечных ДНК.

Моноклональные антитела – однотипные антитела, строго специфичные в отношении одного эпитопа (антигенной детерминанты). Синтезируются гибридомами – клеточными гибридами, полученными при слиянии нормальных антителообразующих клеток с миеломной опухолевой клеткой, способной к

36

неограниченному росту. Некоторые миеломные клетки синтезируют мононоклональные тела самостоятельно.

Плазмида – внехромосомный генетический элемент, способный к длительному автономному существованию и репликации. Обычно это двухцепочечная кольцевая ДНК длиной 1-200 т.п.н.

Прокариоты – организмы, у которых нет ограниченных мембранами ядра и органелл. К прокариотам относятся все бактерии.

Промотор – участок молекулы ДНК, с которым связывается РНК-полимераза, что сопровождается инициацией транскрипции соответствующих генов. Обычно находится перед 5-концом регулируемого гена.

Профаг – ДНК бактериофага, интегрированная в геном бактериальной клеткихозяина и реплицирующаяся в месте с ней.

Репликация – процесс самовоспроизведения (синтеза) ДНК.

Ретровирусы – группа РНК-содержащих вирусов, содержащих обратную транскриптазу; синтезированная на РНК-матрице двухцепочечная ДНК может встраиваться в хромосому инфицированной этим вирусом клетки.

Рибосома – клеточная органелла, рибонуклеопротеидная частица, при участии которой осуществляется синтез белка (трансляция). Состоит из двух субчастиц, большой и малой.

Скрининг – метод (или комплекс методов) идентификации единичного объекта (особи в популяции, клетки с искомыми свойствами, участка нуклеотидной последовательности и т.д.) путем перебора большого числа объектов.

Соматическая клетка – любая неполовая клетка многоклеточного организма.

Сплайсинг – вырезание из предшественника м РНК интронов и ковалентное соединение экзонов с образованием зрелых молекул м РНК.

Стволовые клетки – митотически активные стволовые клетки, в результате деления которых происходит замещение погибших клеток в многоклеточном организме.

Структурный ген – ген, кодирующий какой-либо белок.

Трансгенный организм – организм, геном которого содержит чужеродный генетический материал, включенный методами генной инженерии.

37

Эндонуклеаза – фермент, гидролизующий внутренние фосфодиэфирные связи и расщепляющий молекулы ДНК и РНК. Эндонуклеазы участвуют в рекомбинации, репарации и рестрикции; в последнем случае называются рестриктазами (рестрицирующими эндонуклеазами).

Эндотоксин – токсин, не выделяемый клеткой в окружающую среду, а входящий в состав клеточной стенки; многие эндотоксины вырабатываются грамотрицательными бактериями и вызывают воспаление.

Энхансер – специфический участок ДНК, многократно увеличивающий уровень транскрипции генов, расположенных на той же молекуле ДНК.

Эукариоты – организмы, у которых: 1) имеется ядро, где содержатся хромосомы; 2) в цитоплазме присутствуют различные органеллы – митохондрии, хлоропласты и т.д. К эукариотам относятся животные, растения, грибы, некоторые водоросли.

Ядерное клонирование – получение живого организма из безъядерной яйцеклетки с вживленным диплоидным соматическим ядром.

39

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ И РЕКОМЕНДОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. / Б. Глик. Д. Пастернак. – Москва: Мир, 2002. – 589 с.:ил.

2.Завертяев, Б.П. Биотехнология в воспроизводстве и селекции крупного рогатого скота / Б.П. Завертяев. – Л.: Агропромиздат. Ленингр. Отд-ние,

1989. – 255 с.

3.Сельскохозяйственная биотехнология: учеб. / В.С. Шевелуха [и др].-

М.: Высш. шк., 2003. – 469 с.: ил.

4.Красота, В.Ф. Биотехнология в животноводстве / В.Ф. Красота, Б.П. Завертяев, Е.К. Меркурьева, А.К. Никитин - М.: Колос, 1994. -127 с.

Интернетресурсы:

1.http://www.transgen.ru/

2.http://www.cbio.ru/

40