Основы клеточной и генетической инженерии (90

1.2Инструменты генетической инженерии, технология

2.3Клонирование, как способ совершенствования существующих

3

ВВЕДЕНИЕ

Генетическая инженерия, как один из наиболее молодых и перспективных разделов генетики, возникла в конце 70-х годов, когда в лаборатории Поля Бэрга впервые была синтезирована рекомбинантная молекула ДНК.

По А.А. Баеву, генетическая инженерия – это конструирование in vitro функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК), или иначе – создание искусственных генетических программ.

Генетическая инженерия позволяет вводить в ядерный аппарат реципиента не только отдельные новые гены и регуляторные последовательности, не присущие данному организму, но и получать новые формы организмов путём введения целых хромосом, отдельных органелл или слияние двух клеток. Генетическая инженерия и «генная» инженерная часто употребляются как синонимы, хотя понятие «генетическая» является более широким, так как включает в себя манипулирование не только отдельными генами, но и более крупными частями генома.

Термин «биотехнология» был придуман в 1917 г. венгерским инженером Карлом Эреки для описания процесса крупномасштабного выращивания свиней с использованием в качестве корма сахарной свеклы. Растения и животные стали естественными биореакторами, продуцирующими новые или измененные генные продукты, которые никогда не могли бы быть с озданы методами мутагенеза и селекции или скрещивания.

На стыке технологии рекомбинантных ДНК и биотехнологии возникла новая область исследований – молекулярная биотехнология, которая является фундаментальной основой генетической инженерии.

4

ТЕМА 1. ОСНОВЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГЕНЕТИКИ

1.1 Объекты молекулярной биотехнологии

Цель занятия. Изучить основные объекты молекулярной биотехнологии,

инструменты генетической инженерии, используемые для получения рекомбинантных молекул ДНК.

В качестве объектов молекулярной биотехнологии используются различные биологические системы: микроорганизмы, клеточные линии насекомых, растений, млекопитающих, вирусы насекомых, растений и млекопитающих, многоклеточные организмы, выбор системы зависит от целей эксперимента.

Основными «рабочими лошадками» в молекулярной биотехнологии являются бактерии Escherichia coli, одноклеточные дрожжи Saccharomyces cerevisiae и различные клеточные линии животного происхождения.

Все живые организмы делятся на две основные группы: прокариоты и эукариоты.

Рис. 1 Прокариотическая бактериальная клетка и эукариотическая животная

клетка (Б. Глик, 2002)

5

Отличительными особенностями данных клеток являются наличие или отсутствие ядра, содержащего хромосомную ДНК;

-строение и химический состав клеточной стенки;

-наличие или отсутствие субклеточных цитоплазматических органелл. Кишечная палочка Escherichia coli является прокариотическим

организмом, хромосомная ДНК которой находится непосредственно в цитоплазме, клетка окружена ригидной клеточной стенкой, в клетке нет субклеточных цитоплазматических органелл.

Логичность и простота схемы данного организма дала возможность считать её универсальной для всего живого, в том числе и для эукариотических организмов, имеющих ядро, к которым относятся животные, растения и человек.

Вся информация о строении и функционировании любого живого организма содержится в закодированном виде в его генетическом материале, основу которого составляет ДНК.

Молекула ДНК – сложный биополимер, имеющий у эукариот двухнитчатую спиральную форму, у прокариот – однонитчатую. Навитые одна на другую полинуклеотидные цепи удерживаются вместе водородными связями, образующимися между комплементарными основаниями противоположных цепей. Каждый нуклеотид состоит из фосфора, сахара, и

четырёх азотистых оснований: пуриновых – аденин (А), гуанин (Г) и пиримидиновых – тимин (Т) и цитозин (Ц). При этом аденин образует пару только с тимином, а гуанин – с цитозином. В состав молекулы ДНК входят, чередуясь в определённой последовательности, многие тысячи нуклеотидов.

Число нуклеотидов и их последовательность в молекуле ДНК специфичны для каждого вида организмов и конкретной особи.

Для получения ценных биотехнологических продуктов используют гены самых разнообразных организмов. Наследственная информация, хранящаяся в ДНК, является «проектной документацией» того, какие белки и с какими свойствами должны синтезироваться клетками.

6

Длинная молекула ДНК несёт информацию о том, как расположены аминокислоты в белках, и тем самым определяет их функциональные возможности. Следует отметить, что генетический код универсален. Он одинаков для всех живых организмов, начиная с вирусов и заканчивая человеком. Эта особенность его используется генной инженерией для создания активных и жизнеспособных молекул рекомбинантных ДНК.

Процесс реализации наследственной информации в биосинтезе осуществляется при участии трёх видов рибонуклеиновых кислот (РНК): информационной (матричной) – и РНК (м РНК), рибосомальной – р РНК и транспортной – т РНК. Все рибонуклеиновые кислоты синтезируются на соответствующих участках молекул ДНК.

Сначала на определенном участке ДНК как на матрице синтезируется матричная РНК (м РНК). Затем с участием транспортных РНК (т РНК), м РНК, ферментов и различных белковых факторов осуществляется синтез белковой молекулы. В результате информация, зашифрованная в ДНК с языка нуклеотидов переводится на язык аминокислот.

Процесс биосинтеза сложный и включает ряд этапов – транскрипцию, сплайсинг и трансляцию. Молекула ДНК, находящаяся в ядре, способна к самовоспроизведению – репликации. Первый этап биосинтеза заключается в накоплении дочерних молекул ДНК.

Молекула ДНК на данном этапе служит матрицей. С каждой нити матричной ДНК списываются комплементарно последовательность и состав нуклеотидов, образуя молекулу информационной РНК. Этот процесс называется транскрипцией.

Транскрипция – (переписывание, копия) происходит в ядре клетки: на участке определённого гена молекула ДНК синтезируется м РНК. В синтезе участвует комплекс ферментов, главным из которых является РНК-полимераза. После транскрипции, в результате которой на нити и РНК записана последовательность нуклеотидов матричной ДНК, происходит вырезание (рестрикция) из и РНК незначащих участков РНК (нитронов) и соединение в

7

общую нить, склеивание значащих участков ДНК (экзонов). Процесс вырезания и склеивания экзонов называется сплайсингом. После сплайсинга формируется нить и РНК, её молекулы переходят из ядра в цитоплазму клетки и направляются к рибосомам.

Комплекс, состоящий из и РНК, р РНК, т РНК и аминокислоты формируют рибосому, в которой начинаются биосинтез первичной полипептидной молекулы специфического белка (фермента), соответствующего структуре молекул и РНК, р РНК и ДНК.

Трансляция – происходит в цитоплазме на рибосомах при участии т РНК. Транспортные РНК синтезируются в ядре, но функционируют в свободном состоянии в цитоплазме клетки.

Задание: изучить основы молекулярной генетики.

Задание №1: выявить отличительные признаки прокариот и эукариот. Задание выполнить по форме таблицы №1, наличие или отсутствие тех или иных признаков отмечать знаками « + », « - ».

Таблица 1 - Сравнительная характеристика эукариот и прокариот

Задание №2: зарисовать строение клеток эукариот и прокариот.

Задание №3:ответить на вопросы:

8

1. Что такое репликация, трансляция, транскрипция?

2. Какой аминокислотной последовательности отвечает следующая нуклеотидная последовательность: GCGATAATGCCGTAATCC.

Домашнее задание: изучить и зарисовать схему синтеза белка

1.2 Инструменты генетической инженерии, технология рекомбинантных ДНК

Технология рекомбинантных ДНК (молекулярное клонирование) – это совокупность экспериментальных процедур, позволяющая осуществлять перенос генетического материала из одного организма в другой. В генетической инженерии для конструкции рекомбинантных ДНК используются ферменты: рестриктаза, ДНК-полимераза, ДНК-лигаза. Рестрикционные эндонуклеазы (рестриктазы) представляют собой особый класс эндонуклеаз, которые гидролизуют ДНК строго по определенным специфическим последовательностям, называющимися сайтами рестрикции. Каждая из рестриктаз узнает свой сайт рестрикции и разрезает ДНК либо внутри последовательности сайта рестрикции, либо в непосредственной близости от него.

Таким образом, при действии конкретной рестриктазы одна и та же последовательность ДНК будет всегда образовывать одинаковый набор фрагментов. Обозначение рестриктаз складывается из начальных букв латинского названия вида бактерий, из которого был выделен фермент, и дополнительного обозначения, так как из бактерий одного вида может быть выделено несколько различных рестриктаз: Escherichia coli – Eco R J, Eco R V, Haemophilus influenzae – Hinf I и т.д.

Ферментативная активность рестриктаз измеряется в единицах активности. Это такое количество фермента, которое необходимо для полного гидролиза за один час 1 мкг ДНК фага λ (лямбда) при оптимальных условиях.

9

ДНК-полимераза - фермент обладающий способностью удлинять цепь ДНК путем присоединения комплементарного нуклеотида, это свойство используется при создании ДНК-библиотек, для заполнения «бреши» в цепи ДНК.

ДНК-лигаза осуществляет одну функцию – соединение фрагментов ДНК путем восстановления фосфодиэфирных связей между соседними нуклеотидами. Этот процесс называется лигированием. Лигазы в клетках участвуют как в синтезе ДНК, так и при восстановлении нормальной структуры ДНК после частичного повреждения генетического аппарата. Наиболее изучены ДНК-лигазы клеток E. сoli и фага Т4.

Эксперимент с рекомбинантной ДНК проводят по следующей схеме

(рис.2, 3) (Б. Глик, 2002).

Рис.2. - Клонирование рекомбинантной ДНК (Б. Глик, 2002)

Рис. 3 - Схемы действия рестриктазы E. сoli R1 (Б.П. Завертяев, 1989)

10