130793

4. Простерелизовать в автоклаве в течение 20 мин при давлении 1 атм. пробирки с питательной средой, закрытые ватными пробками. Перед автоклавированием со средой завернуть их по 10—20 шт. в целлофан или оберточную бимагу и автоклавировать под давлением 1 атм. в течение 20 мин.

Работа 3. Выращивание стерильных проростков

Материалы и оборудование: семена сои, гороха, фасоли, огурца и др.; стерильные чашки Петри (1 шт.), стерильная коническая колба на 300—500 мл, дно которой покрыто смоченной водой ватой или фильтровальной бумагой, пробирки с половинной питательной средой М-С без гормонов, стерильная вода, стерильные химические стаканы (2 шт.).

Пояснение к выполнению работы. Стерильные проростки выращивают с целью получения эксплантов для введения в

каллусную или опухолевую культуру. В зависимости от задачи опыта семена проращивают на воде или на агаризованной питательной среде.

Ход работы. Отобрать 10 здоровых, одинаковых по размеру семян, тщательно промыть их в мыльном растворе, затем водопроводной и дистиллированной водой. Поместить в марлевые мешочки и погрузить на 1—2 мин в 96%-й спирт, после чего простерилизовать в 0,1 %-м растворе сулемы или диацида в течение 15 мин. Затем промыть в стерильной воде, сменяя ее 5—6 раз.

В ламинаре с помощью стерильного пинцета разложить 10 семян в стерильную колбу на влажную вату или фильтровальную бумагу; мелкие семена (табака, моркови пт. д.) можно проращивать в чашках Петри на фильтровальной бумаге, обильно смоченной стерильной водой. Для получения проростков на питательной среде поместить по 1 семени в пробирку со стерильной средой М-С (1/2 концентрации). Пробирки, колбы и чашки Петри с семенами поставить в термостат при температуре 25...26°. Для получения неэтиолированных проростков семена проращивают на свету при той же температуре.

Тема 2. КУЛЬТУРА КАЛЛУСНОЙ ТКАНИ

Каллус — это неорганизованно растущая ткань, состоящая из дедифференцированных клеток. Образование и рост каллусной ткани контролируются фитогормонами из группы ауксинов и цитокининов. Под действием ауксинов происходит дедифференцировка, а под влиянием цитокининов— интенсивное деление, в результате которого

образуется ткань. Для индукции каллусообразования используются питательные среды с высоким соотношением ауксина и цитокинина. Каллусную ткань можно получить на искусственных питательных средах, включающих фитогормоны, из разных частей растения: стеблей, корней, тканей клубня, листьев, зародышей и др.

Работа 4. Получение и культивирование каллусной ткани из

сердцевинной паренхимы табака

Материалы и оборудование: взрослые растения табака в состоянии цветения; химический стакан с дистиллированной водой, вата, 96%-й этиловый спирт, 0,1 %-й раствор сулемы или диацида, стерильный стакан, стакан для слива, стерильные марлевые мешочки, стерильные пробкобур, скальпель, стерильная чашка Петри, пробирки со стерильной питательной средой М-С, содержащей гормоны: ИУК (2 мг/л), кинетин (0,2 мг/л).

Пояснение к выполнению работы. Табак — классический объект для получения каллусной ткани и дальнейших ее исследований. Клетки табака легко дедифференцируются и переходят к делению, образуя быстрорастущую каллусную ткань. Кроме того, в каллусной ткани табака легко можно вызвать регенерацию.

Метод получения каллусной ткани из сердцевинной паренхимы табака (СПТ) разработан в лабораториях Скуга и Бутенко.

Ход работы. Из стеблей табака в фазе бутонизации или цветения вырезать участки с хорошо развитой, но еще не одревесневшей сердцевиной (2—3- е междоузлия). Разрезать их на куски длиной 5 см, вымыть в мыльном растворе щеткой, отмыть от мыла водопроводной водой и ополоснуть дистиллированной водой. Поместить в стакан с дистиллированной водой, сверху положить вату, тогда стебли не будут всплывать (необходимо следить, чтобы они все время находились в вертикальном положении). Перенести в ламинар для стерилизации и высадки на питательную среду.

Для стерилизации протереть стебли 96%-м этанолом, погрузить в марлевых мешочках в 0,1 %-й водный раствор сулемы на 10—15 мин или в раствор диацида (1 : 1000) на 25 мин. Затем промыть их в 5 порциях дистиллированной воды, оставляя в каждой порции на 5 мин. Из самой центральной части стебля стерильным сверлом для пробок (диаметр 5 мм) вырезать столбик сердцевинной ткани и поместить в стерильную чашку Петри. Стерильным скальпелем удалить участки ткани около срезов (концевые участки). Вырезанная сердцевина не должна содержать элементов флоэмы и камбия. Полученные цилиндрики сердцевины разрезать скальпелем в чашке Петри на кусочки высотой 2—3 мм. Стерильно перенести их на

поверхность агаровой среды М-С в пробирки и слегка вдавить экспланты в питательную среду. Пробирки поместить в термостат при температуре 26° для культивирования каллусной ткани. Через 3 недели рассмотреть и зарисовать результаты опыта.

Работа 5. Получение и культивирование каллусной ткани из корнеплодов моркови.

Материалы и оборудование: корнеплоды моркови; пробкобуры, стерильный скальпель, стерильный пинцет, стерильная чашка Петри, стерильные листы бумаги, чашка Петри со стерильной питательной средой М-С (приложение, табл. 1) с добавлением 2 мг 2,4-Д и 0,2 мг кинетика на 1 л.

Пояснение к выполнению работы. Впервые культура каллусной ткани из корнеплода моркови была получена Готре в 1939 г. Эта ткань, благодаря пассированию ее на свежую питательную среду, продолжает расти неопределенно долгое время, не утрачивая способности к делению. Образование каллуса происходит в области первичных или вторичных меристем, а также из паренхимы, прилегающей к этим меристемам или вторичным сосудистым тканям. Инициация каллуса из паренхимы или камбия активируется наличием в экспланте зрелой сосудистой ткани.

Процесс каллусообразования зависит от размера экспланта. Чем он крупнее, тем разнообразнее набор клеток, что обусловливает более сложные отношения между основной тканью и клетками, дающими начало каллусу. Первичный эксплант обычно имеет размер 5—10 мм3 и массу 20—100 мг.

Многие ткани обладают физиологической полярностью, что необходимо учитывать при получении каллуса на фрагментах корня моркови. Их надо помещать на агар апикальной стороной.

Ход работы. Отобрать здоровые корнеплоды моркови, тщательно вымыть щеткой с мылом, затем отмыть водопроводной водой и погрузить для стерилизации в 96%-й этанол на 5 мин без дальнейшей отмывки стерильной водой.

В стерильных условиях отрезать верхнюю часть корнеплода моркови и стерильным пробкобуром извлечь цилиндры из ткани. Эксплант корнеплода моркови должен содержать ксилемную, флоэмную паренхиму и камбий. Вычлененные цилиндры поместить в стерильную чашку Петри и разрезать на диски шириной 1—2 мм, сделать надсечки и перенести с помощью пинцета на питательную среду М-С (приложение,табл. 1), содержащую 2,4-Д и кинетин. Культивировать в термостате при температуре 25°. Через 3 недели рассмотреть и зарисовать образовавшуюся каллусную ткань.

Работа 6. Получение и культивирование каллуса из стебля стерильного растения картофеля

Материалы и оборудование: стерильное растение картофеля в пробирке; стерильный пинцет и скальпель, стерильный матрасик или чашка Петри, спиртовка, спирт в фарфоровом стаканчике, стерильная питательная среда для получения и культивирования каллуса картофеля (приложение, табл. 6) в колбочке или пробирке, парафилм, ножницы, спички.

Пояснения к выполнению работы. В ответ на поранение паренхимные клетки, помещенные в питательную среду, содержащую фитогормоны, дедифференцируются, переходят к делению и образуют каллус. У картофеля каллус может быть получен из тканей стебля, листа, клубня, пыльника. Рассмотрим получение каллуса из стебля стерильного растения.

Ход работы. Протереть ламинар изнутри спиртом. Пробирку протереть спиртом, горлышко обжечь. Пинцетом вынуть стерильное растение из пробирки и выложить его на стерильный матрасик. Придерживая растение пинцетом, вырезать скальпелем участки стебля длиной 5—10 мм, не захватывая междоузлия. Надсечь экспланты стебля острым скальпелем в нескольких местах, для появления в дальнейшем раневого каллуса. Нагреть стерильную среду на плитке до расплавления агара, остудить до 37...46° (температура определяется рукой: дно колбы должно быть теплым). Открыть колбу, обжечь ее горлышко над пламенем спиртовки. В стерильные чашки Петри, предварительно вынутые из крафта, разлить среду - по 15—30 мл. Чашки держать открытыми минимальное время. Дать среде застыть (это займет 10—15 мин). Надсеченные экспланты стебля разместить на поверхности агаровой среды, чуть вдавливая их пинцетом для усиления контакта со средой. В одну чашку помещают 10—20 эксплантов. Закрыть чашку Петри и заклеить парафилмом в 2 слоя. Парафилм следует равномерно натягивать для предотвращения разрывов при его усыхании. Поставить чашки Петри в термостат без освещения при температуре 22.-..250 и влажности 70%. Через 3 недели рассмотреть и зарисовать образовавшийся каллус.

Работа 7. Пассирование каллусной ткани на свежую питательную среду.

Материалы и оборудование: культура каллусной ткани картофеля, пшеницы, табака; пробирки со стерильной агаризованной средой,

стерильный пинцет, стерильный скальпель, спиртовая горелка, спички, стерильная чашка Петри, 96%-й спирт.

Пояснение к выполнению работы. Кривая роста каллусной ткани носит S- образный характер. Она состоит из следующих фаз: начальной (лаг-фазы), логарифмического роста, во время которой идет активное деление клеток, замедленного роста, стационарной и деградации. Для того чтобы сохранить способность к делению и дальнейшему росту, кусочек каллусной ткани переносят на свежую питательную среду. Этот прием поддержания клеточных делений носит название пассирования тканей. Пассировать ткань можно неограниченное число раз. Однако при многократном его повторении возможно «привыкание», которое выражается в приобретении автономности по отношению к гормонам и утрате или значительному ослаблению способности каллусных клеток к регенерации целого растения.

Ход работы. Перенести, соблюдая строгую стерильность, каллус на свежую питательную среду. Отделить старые некротизированные участки и кусочки приставшей агаризованной среды. Затем каллусную ткань делят на равные кусочки и асептически переносят в пробирки со стерильной питательной средой. Вся операция осуществляется следующим образом: в левую руку берут пробирку с питательной средой, а правой вынимают из нее пробку. Горлышко пробки обжигают на спиртовке. Затем свободными пальцами левой руки приподнимают крышку чашки Петри, а правой рукой

спомощью стерильного пинцета переносят кубики каллусной ткани в пробирку со свежей питательной средой, слегка вдавливая их пинцетом в агар. После этого обжигают горлышко пробирки, ватную пробку и закрывают пробирку пробкой. Верхнюю часть пробирок обертывают целлофаном и на пробирки ставят дату посева и фамилию студента.

Пробирки поместить в термостат с температурой 25° и влажностью 60% на 3—4 недели. В конце этого срока пронаблюдать и зарисовать пробирки

скаллусной тканью.

Тема 3. ВТОРИЧНАЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКА И МОРФОГЕНЕЗ В КУЛЬТУРЕ КАЛЛУСНЫХ ТКАНЕЙ. ПОЛУЧЕНИЕ РАСТЕНИЙ-РЕ ГЕНЕ РАНТОВ

Конечной ступенью всех работ по культуре растительных клеток и тканей, за исключением тех случаев, когда клеточная суспензия используется для получения вторичных метаболитов, является регенерация из каллусных клеток растения. В ее основе лежит вторичная дифференцировка каллусной клетки.

Благодаря присущему клетке свойству тотипотентности из каждой каллусной клетки (независимо от того, из какого органа растения был взят эксплант) может регенерировать целое растение. Однако эта

потенциальная способность реализуется далеко не всегда. До сих пор не получены растения - регенеранты из одной изолированной клетки (протопласта) большинства хлебных злаков: пшеницы, ржи, кукурузы и др. (исключение составляет рис), некоторых бобовых растений. Разные генотипы в пределах любого вида растений могут проявлять неодинаковую регенерационную способность. Поэтому изучение механизма регенерации растений из каллусных клеток, оптимизация питательных сред и условий культивирования для индукции морфогенеза являются одним из важнейших вопросов культуры изолированных клеток и тканей растений.

Индуцировать морфогенез в культуре каллусной ткани можно с помощью внешних и внутренних факторов: света, температуры, состава питательной среды, и в первую очередь - изменения соотношения фитогормонов. Так, пересадка каллусной ткани на среду, в которой цитокинины преобладают над ауксинами, приводит к регенерации побега, на среде с преобладанием ауксинов индуцируется ризогенез.

Существуют различные типы морфогенеза: соматический эмбриогенез и органогенез, который, в свою очередь, подразделяется на стеблевой, корневой и флоральный. При соматическом эмбриогенезе из каллусных клеток формируются биполярные зародышеподобные структуры, у которых развиваются стебелек и корешок. В случае стеблевого органогенеза образовавшийся побег пересаживают на среду с повышенным содержанием ауксинов. Если же морфогенез пошел по типу корневого органогенеза, то получить из корней побеги не удается.

Работа 8. Индукция стеблевого органогенеза в культуре каллусной ткани картофеля

Материалы и оборудование: пробирки, колба со средой для морфогенеза (приложение, табл. 7), длинный пинцет, стерильный матрасик, каллус картофеля в пробирке или чашке Петри, спиртовка, спички.

Пояснение к выполнению работы. Для индукции ограногенеза кусочек каллусной ткани, полученной из стеблевого или листового экспланта стерильного растения картофеля (2-й и последующие пассажи), пересаживают на среду с высоким содержанием цитокининов, для укоренения образовавшихся побегов их пересаживают на среду с повышенным содержанием ауксинов. Индукция морфогенеза и регенерация растений - сложный, часто многоступенчатый процесс. У картофеля его можно подразделить на несколько стадий: индукция зеленых меристематических зон, появление апексов, формирование

растения - регенеранта, укоренение регенеранта. Чем моложе каллусная культура (т. е. чем меньше времени прошло с момента ее получения), тем выше регенерационная способность каллуса. Состав сред для индукции морфогенеза и регенерации растения разных сортов картофеля может различаться, но общим правилом является повышенное содержание цитокининов (зеатина или БАП).

Ход работы. Каллус вынуть из пробирки на матрасик, разделить его на кусочки размером 5x5 мм и поместить в пробирку со средой для индукции морфогенеза. Пробирку закрыть пробкой и поставить в световую камеру с температурой 20...25°, освещенностью 10 тыс. лк и влажностью 70%. Через 1 неделю отметить появление глобул, а через 3—5 недель — меристематических зон ярко-зеленого цвета. Еще через 1—2 недели появляются апексы. Записать количество апексов на каждом каллусе. Апексы превращаются в маленькие побеги. На одном экспланте может появиться до нескольких десятков побегов. Когда они достигнут высоты 10 мм, их отделяют от каллуса и переносят на среду для укоренения. Через 5—10 дней отметить появление корней.

Тема 5. КЛОНАЛЬНОЕ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ РАСТЕНИЙ

Под клональным микроразмножением растений понимают бесполое размножение на искусственных питательных средах в условиях in vitro. Этот метод имеет следующие преимущества перед обычными способами вегетативного размножения растений:

1)большие коэффициенты размножения (например, из 1 растения земляники можно получить в год 1 млн растений);

2)растения освобождаются от вирусов и другой инфекции, т. е. происходит оздоровление посадочного материала;

3)возможность проводить работы в течение круглого года;

4)размножение трудноразмножаемых растений, например, роз, орхидей. Кроме того, экономятся площади теплиц, занимаемые под маточные растения. Пробирочные растения легко транспортировать на любые расстояния. Меристемы сохраняются в течение длительного времени с помощью криометода.

Существует несколько методов клонального микроразмножения растений: 1.Активация развития уже существующих в растении меристем (апекс стебля, пазушные и спящие точки стебля); 2.Индукция возникновения адвентивных почек непосредственно тканями экспланта; 3.Индукция соматического эмбриогенеза;

4.Дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани.

Работа 9. Выделение и культивирование апикальных меристем картофеля

Оборудование: клубни картофеля; бинокулярная лупа, скальпели, препаровальные иглы, пробирки со стерильной питательной средой (приложение, табл. 2).

Пояснение к выполнению работы. Культура изолированных апикальных меристем используется для получения свободного от вирусов посадочного материала и для микроклонального размножения растений. Метод основан на том, что к верхушке больного растения содержание вирусов уменьшается. Апикальная меристема обычно совершенно свободна от вирусов, она представляет собой конус активно делящихся клеток высотой 0,1 мм (100 мкм) и шириной 0,25 мм. Поскольку меристему бывает трудно

эффективности оздоровления картофеля применяют сочетание метода верхушечной меристемы с термо- и хемиотерапией. Тепловая обработка вызывает инактивацию вирусов, химические вещества ингибируют их развитие. Выращенные из апикальных меристем безвирусные растения могут быть размножены и высажены в теплицы для получения безвирусных клубней. Для ускоренного размножения оздоровленного материала используются также клубни, образовавшиеся на безвирусных растениях in vitro.

Ход работы. Клубни картофеля хранят при температуре 4...6°, затем проращивают в темноте при 20...22°. Работы то вычленению меристем проводят в простерилизованном с помощью бактерицидных ламп ламинар-боксе. Рабочее место (стол, бинокулярная лупа) и штативы с пробирками протирают спиртом. Инструменты (пинцеты, скальпели, иглы) стерилизуют перед каждым вычленением, погружая в спирт, с последующим обжиганием.

Ростки опустить в химический стакан и залить 0,1 %-м раствором диацида на 3—5 мин (либо 1—6%- м раствором гипохлорита кальция или натрия, либо 0,1 %-м раствором сулемы). Затем не менее 3 раз промыть их стерильной водой, поместить в стерильную чашку Петри и добавить несколько капель стерильной воды для предупреждения подсыхания. Перед вычленением с помощью препаровальной иглы под бинокулярным микроскопом с верхушки ростка удалить покровные листочки, последовательно обнажая боковые и верхушечные меристемы с примордиальными листочками. Меристему, включающую кусочек ткани размером 100— 250 мк без листовых зачатков (примордиев), вычленить обычной тонкой иглой, зажатой в цанговый держатель.

Изолировать можно как верхушечную, так и боковые меристемы. Каждую операцию проводят отдельным простерилизованным инструментом. Меристему на острие иглы перенести на поверхность питательной среды в пробирку, закрыть ее пробкой над пламенем горелки и поставить в штатив. Штатив с пробирками закрыть целлофановым колпаком для предупреждения подсыхания сред и поставить в световую камеру.

;В качестве питательной среды используют модифицированную среду М-С (приложение, табл. 2), заранее приготовленную и простерилизованную в автоклаве при давлении 1 атм. в течение 20 мин.

Через 2, 3, 4 недели проводить наблюдения за развитием из меристем побега и зарисовать этапы этого процесса.

Тема 6. ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ IN VITRO В СЕЛЕКЦИИ РАСТЕНИИ

Существуют 2 направления применения культуры клеток и такней для целей селекции. Одно связано с использованием методов in vitro для получения новых форм растений путем клеточной селекции и соматической гибридизации. Под термином соматическая гибридизация понимают получение гибридов неполовым путем с помощью слияния изолированных протопластов, выделенных из клеток растения.

Другое направление связано со вспомогательным использованием методов in vitro в традиционной селекции для ускорения и облегчения селекционного процесса. Сюда относится преодоление постгамной несовместимости с помощью выделения и культивирования изолированного зародыша (эмбриокультура), а также прогамной несовместимости с помощью оплодотворения в пробирке, получение гаплоидов in vitro и клональное микроразмножение ценных гибридов.

Работа 10. Высев суспензии на селективные среды с добавлением NaCl

Материалы и оборудование: суспензия табака или картофеля; стерильные чашки Петри, стерильный цилиндр, среда для роста каллуса без NaCl, с 0,5; 1,0; 1,5 и 2,0% NaCl (всего 5 вариантов). Среду для роста каллуса разливают в 5 стаканчиков и в каждый добавляют нужное количество NaCl. Затем измеряют pH, доводят его до 5,8; добавляют агар до концентрации 1,2% (двойное количество).

Пояснение к выполнению работы. В основе клеточной селекции лежит генетическая неоднородность каллусных клеток. Для проведения клеточной селекции на солеустойчивость высевают суспензию клеток методом плейтинга на агаризованную питательную среду, содержащую

повышенные количества хлористого натрия. В этом случае выявляется устойчивость клеток как к токсическому действию хлористого натрия, так и повышенному осмотическому давлению питательной среды, т. е. отбираются клетки, обладающие высокой водоотнимающей и водоудерживающей способностью.

Ход работы. Суспензию налить в стерильный цилиндр и дать отстояться 5 мин. Отобрать 10 мл верхней фракции суспензии (она обогащена одиночными клетками) и смешать в стерильном цилиндре с 10 мл среды без NaCl (контроль), расплавленной и охлажденной до 40°. После этого быстро разлить содержимое цилиндра в 5 чашек Петри диаметром 6 см, дать застыть и закрыть парафилмом. Ту же самую операцию провести со средой, содержащей 0,5; 1,0; 1,5; 2,0% NaCl. Обычно плотность высева равняется 1 Х:104 клеток в 1 мл. Через 4 недели подсчитать в каждой чашке колонии размером более 1 мм. Сравнить количество колоний на селективных средах и на контрольной среде, приняв контроль за 100%. Определить эффективность высева при каждой концентрации NaCl.

количество образовавшихся колоний х 100

Эффективность высева = количество высеянных клеток

Колонии, выросшие на 1,5 и 2,0% NaCl, пересадить на среду для морфогенеза, в которую может быть добавлен хлористый натрий. Растения проверить на устойчивость к NaCl (1%) и сравнить их с исходными (из которых был получен каллус для суспензии) или с растениями, регенерировавшими из клеточных линий, которые росли без NaCl.

Библиографический список 1.Биотехнология растений: культура клеток / Под ред. Р. Г. Бутенко. М.: Агропромиздат, 1989 (пер. с англ.).

2 . Бутенко Р. Г. Культура клеток растений и биотехнология. М.: Наука,

1986.

3.Г'леба Ю. Ю., Сытник К. М. Клеточная инженерия растений. Киев: Наукова думка, 1984.

4 . Зубко М. К. и др. Методы культивирования растительных объектов in vitro/ АН УССР, Институт ботаники. Киев, 1988.

5.Катаева Н. В., Бутенко Р. Г. Клональное микроразмножение растений.

М.: Наука, 1983.

6 . Муромцев Г. С. и др. Основы сельскохозяйственной биотехнологии.

М.: Наука, 1990.

7 . Шевелуха В. С. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. М.:

МСХА, 1998.