130793

ПРИЛОЖЕНИЕ Т а б л и ца 1 Состав питательных сред для культивирования изолированных тканей растений

ПРИЛОЖЕНИЕ Т а б л и ца 2 М о д и ф и ц и р о в а н н а я питательная среда Мурасиге -

Скуга для культивирования апикальных меристем картофеля

Компоненты питательной среды, мг/л

ПРИЛОЖЕНИЕ Таблица 3 Модифицированная питательная среда Мурасиге -

РЕГУЛЯТОРЫ РОСТА И РАЗВИТИЯ РАСТЕНИЙ

Тема 1. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФИТОГОРМОНОВ

Фитогормональная система - основная система регуляции целостности растительного организма, а также реакций растения на изменение условий внешней среды. Она основана на влиянии фитогормонов на экспрессию генов, а следовательно - синтез новых белков и изменение активности ферментов, транспортных и других функционально значимых белков, уже существовавших в клетке. Фитогормоны образуются в растении, причем образование того или иного фитогормона имеет максимумы и минимумы, соответствующие определенным внешним условиям. Молекулы фитогормона транспортируются в другие ткани и органы, где соединяются со специфическими белковыми рецепторами, образуя активное физиологическое соединение - гормон-рецепторный комплекс. Образование данного комплекса активирует синтез вторичных посредников, которые, в свою очередь, активируют протеинкииазы, специфически фосфорилирующие белки. Фосфорилирование приводит к изменению пространственной конформации белков, что в случае репрессоров приводит к репрограммированию генома, появлению новых ферментов и соответственно — новых признаков. При этом физиологический ответ наступает через несколько часов, так как это обусловлено длительным процессом биосинтеза белка. В том случае, когда происходит изменение конформации существующих в клетке белков, физиологический ответ наступает уже через несколько минут после изменения концентрации фитогормона.

Работа 1. Индукция синтеза а-амилазы клетками алейронового слоя под действием гиббереллина

Материалы и оборудование: зерновки ячменя, гиббереллин (ГКз), агарагар, картофельный крахмал, йодистый калий и металлический йод для приготовления окрашивающего раствора, этиловый спирт; скальпели, пинцеты, фильтровальная бумага, чашки Петри, термостойкие стаканы на 700 мл, мерная посуда для приготовления растворов, электроплитка, термостат.

Пояснение к выполнению работы. Примером избирательного воздействия фитогормонов на геном служит вызываемая гиббереллином экспрессия гена а-амилазы в клетках алейронового слоя зерновки ячменя.

а-амилаза, наряду с В-амилазой и глюкоамилазой, относится к группе ферментов, осуществляющих гидролиз а-1,4-гликозидных связей в крахмале и родственных поли- и олигосахаридах. Продуктами гидролиза являются мальтоза, мальтотриоза, глюкоза и ряд низкомолекулярных продуктов с разветвленной цепью, а-амилаза в отличие от других амилаз, которые постоянно в небольших количествах присутствуют в растительных клетках, синтезируется при наступлении благоприятных, условий для прорастания семени. При набухании зародыш продуцирует гормон — гиббереллин. Гиббереллин диффундирует к клеткам алейронового слоя, соединяется с белками-рецепторами, образуя активный гормон-рецепторный комплекс, который снимает репрессорную блокаду, препятствующую экспрессии гена а-амилазы.

Готовый фермент, в свою очередь, диффундирует в эндосперм и расщепляет крахмал до растворимых сахаров, которые впитываются щитком и служат энергетическим и структурным материалом для роста зародыша. В зерновке с удаленным зародышем нет а-амилазы, так как нет гиббереллина - индуктора биосинтеза этого фермента. Добавление раствора гиббереллина к таким зерновкам включает биосинтез а-амилазы. Контроль проводится по степени разложения крахмала в крахмальном агаре при окрашивании его раствором йода в йодистом калии.

Ход работы. У зерновок отрезать зародыш и заложить в 2 чашки Петри. В 3-ю чашку заложить интактные семена (примерно по 100 зерновок на чашку). Приготовить 20 мл раствора гиббереллина концентрацией 50 мг/л. Для этого на аналитических весах взвесить в бюксе 10 мг гиббереллина (ГКз) и растворить в 2 мл 70%-го этилового спирта. Перенести в мерную колбу на 50 мл и довести до метки дистиллированной водой, перемешать. Отобрать 5 мл этого раствора и добавить 15 мл дистиллированной воды, перемешать. Залить приготовленный раствор в чашку Петри, куда помещены семянки с удаленным зародышем. В две другие чашки залить по 20 мл дистиллированной воды. Надписать чашки Петри с зерновками и поставить в термостат при температуре 27° на 24—48 ч.

Приготовить крахмальный агар. Для этого поместить в термостойкий стакан 6 г мелко нарезанного агара, прилить 300 мл воды и, помешивая, кипятить до полного растворения.

6 г крахмала размешать стеклянной палочкой с 30 мл воды и влить в кипящий агар, вновь довести до кипения. Горячую смесь разлить в предварительно подогретые чашки Петри (по 5— 7 мл на чашку).

Приготовить раствор йода в йодистом калии. Для этого 2 г йодистого калия растворить в 5 мл дистиллированной воды, добавить 1 г металлического йода и после полного растворения последнего

прилить 295 мл воды. Перелить в темную посуду с притертой пробкой.

Остывший крахмальный агар в чашке Петри разделить скальпелем на 3 сектора и обозначить их соответственно вариантам инкубации. Инкубированные в термостате семянки разрезать вдоль пополам и осторожно положить срезом на агаровый слой в чашку Петри. Каждый вариант инкубации следует помещать в своем секторе. Через 1 ч осторожно снять зерновки с агара и на 5 с залить агаровый слой раствором йода в йодистом калии. Слить раствор. Светлое окрашивание мест, где лежали зерновки, указывает на то, что крахмал растворился под действием а-амилазы и, следовательно, этот фермент синтезировался.

Тема 2. УПРАВЛЕНИЕ ПРОЦЕССАМИ РОСТА И ПОКОЯ РАСТЕНИИ С ПОМОЩЬЮ ФИТОРЕГУЛЯТОРОВ

Применение фиторегуляторов в практике сельскохозяйственного производства позволяет активно управлять жизнедеятельностью растений. Подавляющее большинство современных фиторегуляторов воздействует на растения за счет влияния на фитогормональную систему, являясь аналогами или ингибиторами фитогормонов. Фиторегуляторы широко применяются в настоящее время для повышения продуктивности многих сельскохозяйственных культур, борьбы с полеганием, стимулирования корнеобразовэния. Разрабатываются и внедряются приемы улучшения качества хранения и повышения устойчивости растений к неблагоприятным климатическим воздействиям.

Работа 2. Укоренение листовых черенков фасоли обыкновенной с помощью аналогов ауксина

Материалы и оборудование: 10-дневные проростки фасоли; маточные растворы фиторегуляторов, эталонный раствор ауксина концентрацией 10 мг/л, скальпели, пинцеты, чашки Петри, фильтровальная бумага, мерная посуда для приготовления растворов, термостат.

Пояснение к выполнению работы. Одной из функций фитогормона ауксина является стимулирование корнеобразования. Однако природный ауксин — индолил-3-уксусная кислота - очень быстро разрушается под действием света. Поэтому для индукции корнеобразования применяют стабильные аналоги ауксина. Молодые листья фасоли высокоспецифично реагируют на препараты ауксинового действия, образуя корни в зоне прикрепления к рахису. Ход работы. Приготовить растворы фиторегуляторов заданной концентрации. Положить в чашки Петри 2 слоя фильтровальной

бумаги. Залить в каждую чашку 10 мл раствора. Срезать листочки фасоли и выложить их в чашку Петри (по 10 листочков на чашку). Поставить в термостат при температуре 25°, укрыть от света. Измерения проводить через 7 дней. Учесть число образовавшихся корней на каждом листовом черенке. Определить среднее по каждому варианту. Построить график зависимости корнеобразования от концентрации фиторегулятора. Сравнить активность данного фиторегулятора и стандарта — природного ауксина.

Работа 3. Определение цитокининовой активности фиторегуляторов по увеличению массы семядолей тыквенных

Материалы и оборудование: семена тыквы или огурца; растворы фиторегуляторов, скальпели, пинцеты, чашки Петри, фильтровальная бумага, мерная посуда для приготовления растворов, аналитические весы, термостат.

Пояснение к выполнению работы. Цитокинины и их аналоги обладают сильным аттрагирующим действием и способностью открывать устьица, что обеспечивает приток пластических веществ и воды. Это обусловливает их способность увеличивать массу изолированных семядолей растений, в частности семейства

Cucurbitaceae.

Ход работы. Простерилизовать семена тыквы или огурца в слаборозовом растворе марганцовокислого калия, тщательно промыть водой и поставить на проращивание в термостат на 24—48 ч. После раскрытия семенной оболочки выделить семядоли (зародыш удаляется) и взвесить каждую из них на аналитических весах с точностью до третьего знака.

Приготовить растворы фиторегуляторов заданных концентраций. В чашки Петри положить 2 слоя фильтровальной бумаги, расчерченной простым карандашом на 10 или 20 пронумерованных участков, и влить 5 мл испытуемого раствора. В каждую чашку выложить по 10 предварительно взвешенных семядолей тыквы или 20 семядолей огурца. Каждую семядолю выложить в фиксируемый участок. Чашки поместить в термостат при температуре 25° на 3 суток, после чего вновь взвесить каждую семядолю и определить прирост массы. Рассчитать средний прирост по варианту и ошибку средней. Построить график зависимости прироста массы от концентрации препарата. Сравнить цитокининовую активность данного препарата с активностью 6-бензиламинопурина.

Работа 4. Влияние фиторегуляторов на преодоление осмотического и температурного стресса проростками пшеницы

Материалы и оборудование: зерновки пшеницы; растворы фиторегуляторов, полиэтиленгликоль (ПЭГ) молекулярной массой 1500—4000, пинцеты, чашки Петри, фильтровальная бумага, мерная посуда для приготовления растворов, линейки, термостат.

Пояснение к выполнению работы. Устойчивость растений к стрессам, связанным с недостатком воды и повышенной температурой, во многом обусловлена синтезом стрессовых белков, в частности белков теплового шока (БТШ). Чем активнее синтезируются стрессовые белки, тем, выше устойчивость растения. В агрономической практике давно применяются приемы, направленные на увеличение устойчивости, например, закаливание рассады перед высадкой в поле. Как показали последние научные данные, закаливание - это процесс стимулирования синтеза стрессовых белков. Стимулировать синтез этих белков, а значит, и устойчивость растений к стрессу способны и фиторегуляторы. Таким действием обладают аналоги цитокининов и абсцизовой кислоты.

Оценить способность фиторегулятора к стимулированию устойчивости растений можно путем переноса в стрессовые условия предварительно обработанных фиторегуляторами проростков пшеницы. При этом тепловой стресс создается путем нагрева растений, а недостаток влаги имитируется биологически нейтральным осмотиком. Антистрессовое действие препарата можно оценить по увеличению числа выживших проростков и по изменению их длины.

Ход работы. Семена пшеницы простерилизовать в слабо-розовом растворе марганцовокислого калия, тщательно промыть водой. Приготовить растворы фиторегуляторов заданных концентраций. В чашки Петри влить 10 мл испытуемого раствора. В каждую чашку выложить примерно 100 зерновок и поставить на проращивание в термостат на 48 ч при температуре 25°. Отработать 50 примерно одинаковых проростков и в дальнейшем использовать для определения устойчивости к осмотическому и температурному стрессу.

Для определения устойчивости к осмотическому стрессу 50 одномерных проростков поместить в чашку Петри с осмотиком. Для этого приготовить растворы ПЭГ концентрацией 25 и 20%. В большие чашки Петри (диаметр 13 см) положить слой поролона или ваты толщиной 0,5—1,0 см и сверху 2 слоя фильтровальной бумаги и влить 20 мл раствора ПЭГ. Чашки с семенами поставить в термостат

на 3 суток, после чего учесть число погибших проростков (%) и среднюю длину проростка в каждом варианте.

Для определения устойчивости к температурному стрессу 50 одномерных проростков, подготовленных, как описано выше, перенести в большую чашку Петри с поролоновой или ватной подложкой и поместить на 4 ч в термостат при температуре 50°. Затем перенести в термостат при температуре 25° на 3 суток. Провести учеты (%) погибших проростков и измерить среднюю длину проростка в каждом варианте, На основании полученных данных сделать выводы о способности

фиторегулятора оказывать антистрессовое действие.

Работа 5. Определение различного действия ретардантов на проростках пшеницы

Материалы и оборудование: зерновки пшеницы, гиббереллин, ретарданты (хлорхолинхлорид, 2-хлорэтилфосфоновая кислота и др.), перманганат калия, двухъярусные растильни или чашки Петри, марля, фильтровальная бумага, пинцеты, мерная посуда для приготовления растворов, термостат, весы, линейки.

Пояснение к выполнению работы. В сельскохозяйственном производстве в настоящее время широкое распространение получили ретарданты - вещества, замедляющие линейный рост побегов. С их помощью можно бороться с полеганием зерновых, ограничивать избыточный рост картофеля, технических, овощных, плодовых культур и винограда, одновременно стимулируя развитие генеративных органов.

Действие ретардантов связано с их влиянием на гормональную систему растений. Вегетативный рост побегов контролируется комплексом фитогормонов, среди которых основное стимулирующее влияние оказывают гиббереллины. Ретардантный эффект обусловлен способностью подавления активности гиббереллинов.

Большинство ретардантов, применяемых в современном растениеводстве, относится к 4 группам веществ — четвертичным солям аммония, триазолпроизводным, этиленпродуцентам и гидразинпроизводным. Эти и другие известные в настоящее время ретарданты обладают антигиббереллиновым эффектом, однако их действие проявляется неодинаково. Некоторые ретарданты блокируют биосинтез гиббереллина, другие препятствуют его связыванию со специфичным рецептором, т. е. становится невозможным образование и (или) дальнейшее проявление активности гиббереллин-рецепторного комплекса.

Установить, каким действием обладает ретардант, можно с помощью экзогенных, гиббереллинов. Если при их добавлении устраняется

вызванное ретардантами торможение роста, значит, они относятся к блокирующим биосинтез. При блокировании ретардантами гормонрецепторного комплекса такого явления не наблюдается.

Моделью для проведения подобных опытов служат проростки пшеницы обладающие повышенной реакцией как на обработку ретардантами, так и на обработку гиббереллином. Кроме того, на данной модели удобно изучать рострегулирующее действие новых препаратов, а также определять эффективность совместного действия ретардантов и разрабатывать оптимальные смеси.

Ход работы. Семена пшеницы простерилизовать в слабо-розовом растворе марганцовокислого калия, тщательно промыть водой. Промытые семена выложить в чашки Петри, обильно смочить дистиллированной водой и выставить на 24 ч в термостат при температуре 26° для проращивания.

Приготовить растворы фиторегуляторов (концентрации указывает преподаватель) и вылить в растильни или чашки Петри, затем вложить марлю или фильтровальную бумагу. На подготовленной таким образом растильне разложить 30 одномерных зерновок, после чего растильни на 7 суток поместить в термостат при температуре

24°.

После экспозиции в термостате отрезать проростки, измерить их длину и массу. Определить число и массу корней. По полученным данным сделать выводы о рострегулирующем действии гиббереллина, ретардантов и различиях ретардантного действия.

Библиографический список

1.Клонирование ДНК/ Под ред. Д. Гловера. М.: Мир, 1988. 2.Молекулярная биология клетки. Т. 1, 2/Алибертс Б., Брей Д., Льюис Дж.

и др. М.: М/ир, 1986.

3 . Шевелуха B . C . и др. Сельскохозяйственная биотехнология. М.:

МС.ХА, 1998.