Методы лабораторной диагностики бактериальных менингитов (менингоэнцефалитов) Учебно-методическое пособие

БИБЛИОТЕКА ПЕДИАТРИЧЕСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

С.В. ВОРОБЬЕВ, А.М. САВИЧЕВА К.В. ШАЛЕПО, Е.В. СПАСИБОВА Т.А. ХУСНУТДИНОВА

А.А. КРЫСАНОВА, О.В. БУДИЛОВСКАЯ

МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ

БАКТЕРИАЛЬНЫХ МЕНИНГИТОВ (МЕНИНГОЭНЦЕФАЛИТОВ)

Санкт-Петербург

УДК 616-076.4

ББК 52.64

М41

М41 Методы лабораторной диагностики бактериальных менингитов (менингоэнцефалитов). Учебно-методическое пособие. / С.В. Воробьев, А.М. Савичева, К.В. Шалепо, Е.В. Спасибова, Т.А. Хуснутдинова, А.А. Крысанова, О.В. Будиловская. – СПб.: СПбГПМУ, 2020. – 24 с.

ISBN 978-5-907321-17-5

В учебно-методическом пособии освещены вопросы лабораторной диагностики бактериальных менингитов (менингоэнцефалитов). Описаны правила получения и приготовления образцов сыворотки крови и ликвора. Рассмотрены основы актуальных диагностических методов, направленных на верификацию возбудителей заболевания: микроскопии, серологических методов, молекулярно-биологической диагностики. Отображены методы определения чувствительности выделенных микроорганизмов к антибиотикам. Кратко изложены методы клинической диагностики менингитов (менингоэнцефалитов), а также основные положения концепции гематоэнцефалического барьера. Кратко описаны отдельные этиологические формы менингитов (менингоэнцефалитов).

Данное учебно-методическое пособие предназначено для специалистов клинической лабораторной диагностики, бактериологов, неврологов, инфекционистов, нейрохирургов, врачей общей практики, лаборантов, медицинских техников и др. Учебнометодическое пособие может быть использовано в качестве учебных материалов при подготовке студентов медицинских ВУЗов, а также при различных формах последипломного обучения.

Рецензенты:

Профессор кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ФГБОУ ВО СПбГПМУ Минздрава России д.м.н. профессор А.М. Королюк

Заведующий кафедрой клинической лабораторной диагностики с курсом молекулярной медицины ФГБОУ ВО ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова д.м.н. профессор В.Л. Эмануэль

УДК 616-076.4

ББК 52.64

Утверждено учебно-методическим советом Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Выпускается при поддержке Фонда научно-образовательных инициатив «Здоровые дети – будущее страны»

2

Менингит представляет собой острое нейроинфекционное заболевание, сопровождающееся преимущественным поражением мягкой и паутинной оболочек головного и спинного мозга. В случае развития менингоэнцефалита в патологический процесс, кроме оболочек, вовлекается также вещество головного мозга.

КЛАССИФИКАЦИЯ

В настоящее время используется несколько классификаций менингитов (менингоэнцефалитов), в основе которых лежат особенности этиопатогенетических механизмов развития и клинико-лабораторных проявлений заболевания. Наиболее значимой с практических позиций представляется классификация, основанная на этиологическом принципе. Наиболее часто возбудителями заболевания являются бактерии (30–35%) и вирусы (60–65%). Значительно реже встречаются менингиты, вызванные грибами (микотические), а также микоплазмами, простейшими, гельминтами, риккетсиями, амебами. Кроме того, практическую ценность имеет классификация, основанная на характере изменений состава цереброспинальной жидкости (ЦСЖ). Согласно этой градации, выделяют две большие группы: гнойные и серозные менингиты (менингоэнцефалиты). Гнойные менингиты, как правило, вызываются бактериями, а серозные – вирусами. Исключение составляют туберкулезный, сифилитический и некоторые другие менингиты. Другая классификация подразделяет менингиты (менингоэнцефалиты) на первичные и вторичные. К первичным относятся случаи менингитов (менингоэнцефалитов) развивающиеся без предшествующей инфекции, как самостоятельное заболевание. Наиболее часто к ним относят менингококковый менингит, острый лимфоцитарный хориоменингит и ряд других. Ко вторичным относят менингиты (менингоэнцефалиты), возникающие как осложнение общей или локальной инфекции (пневмококковый, туберкулезный, при гнойном отите и другие), а также после нейрохирургических вмешательств и черепно-мозговых травм. В зависимости от преимущественной локализации патологического процесса выделяют конвекситальные, базальные и цереброспинальные менингиты (менингоэнцефалиты). По течению и остроте развития симптоматики менингиты (менингоэнцефалиты) подразделяют на молниеносные, острые, подострые, хронические, рецидивирующие. По степени тяжести выделяют легкие формы, формы средней тяжести, тяжелые, крайнетяжелые.

ЭТИОЛОГИЯ ГНОЙНЫХ МЕНИНГИТОВ (МЕНИНГОЭНЦЕФАЛИТОВ)

В качестве причины гнойных менингитов (менингоэнцефалитов) рассматривается большое количество патогенных микроорганизмов, однако практическое значение в развитии заболевания имеют лишь несколько из них. У новорожденных основными причинами развития заболевания являются кишечная палочка, листерии, клебсиеллы и энтерококки различных видов. В возрасте от 1 до 50 лет наибольший вклад в возникновение заболеваний вносят 3 микроорганизма. Среди них менингококк, пневмококк и гемофильная палочка. На их

3

долю приходится более 80% всех случаев бактериальных менингитов данной возрастной категории. При этом на долю N. meningitidis приходится около 60% всех случаев бактериальных менингитов, S. pneumoniae 30% и H. influenzae 10%. Остальные микроорганизмы встречаются лишь эпизодически. В возрастной группе старше 50 лет кроме 3 перечисленных микроорганизмов определенную роль в возникновении заболеваний играют листерии и грамотрицательные бактерии. Иная этиологическая структура у больных с посттравматическими и послеоперационными гнойными бактериальными менингитами. Здесь на первое место выходят стафилококки, энтерококки и стрептококки различных видов. Наиболее часто встречается золотистый и коагулазоотрицательные стафилококки. Всего грамположительные бактерии обнаруживаются в 70–80% случаев. Кроме того, достаточно часто высеваются грамотрицательные бактерии (таблица 1).

Таблица 1

Сводные данные возбудителей гнойного бактериального менингита (менингоэнцефалита) у взрослых и детей различных возрастных групп, играющих основную роль в развитии заболевания

ДИАГНОСТИКА МЕНИНГИТОВ (МЕНИНГОЭНЦЕФАЛИТОВ). ПРАВИЛА ИССЛЕДОВАНИЯ ЛИКВОРА И СЫВОРОТКИ КРОВИ

Клинико-лабораторная диагностика гнойных бактериальных менингитов складывается из триады синдромов:

1.Синдрома инфекционного заболевания

2.Оболочечного (менингеального) симптомокомплекса

3.Синдрома воспалительных изменений ЦСЖ.

4

Синдром инфекционного заболевания представляет собой неспецифиче-

ский симптомокомплекс и складывается ряда клинических и лабораторных проявлений, таких как озноб, чувств жара, повышение температуры тела, кожных экзантем, воспалительных изменений в периферической крови (лейкоцитоз со сдвигом влево, увеличение СОЭ и др.).

Оболочечный симптомокомплекс состоит из общемозговых и собственно оболочечных (менингеальных) симптомов. Общемозговые симптомы вызва-

ны раздражением болевых рецепторов мозговых оболочек и внутримозговых сосудов вследствие воздействия токсинов и повышенного внутричерепного давления. К ним относятся головная боль распирающего характера, нередко настолько интенсивная, что больные, даже находясь в бессознательном состоянии громко вскрикивают («гидроцефальный крик»). Нередко беспокоит тошнота. На высоте головной боли часто развивается обильная, так называемая мозговая рвота. При тяжелом течении менингита возникают судороги, психомоторное возбуждение. Степень расстройства сознания варьирует от умеренного оглушения до глубокой комы. Возможны возникновение продуктивной психопатологической симптоматики в виде бреда и галлюцинаций.

Собственно оболочечные симптомы можно подразделить на 3 группы. К первой группе относятся симптомы гиперестезии органов чувств. У больного обнаруживается непереносимость шума или громкого разговора, наблюдается усиление головной боли от сильных звуков и яркого света. Отмечается кожная гиперестезия.

Вторую группу симптомов составляют реактивные болевые феномены. Для их выявления применяются перкуссия или пальпация определенных точек. Например, болезненность при надавливании на глазные яблоки (симптом Лобзина). Симптом Керера – болезненность при пальпации точек выхода затылочных нервов. Симптом Менделя – резкая болезненность при давлении изнутри на переднюю стенку наружного слухового прохода. Скуловой симптом Бехтерева – перкуссия по скуловой дуге вызывает усиление головной боли. Симптом Флатау – расширение зрачков при быстром пассивном сгибании головы больного.

Третью группа симптомов составляют так называемые мышечные тонические напряжения или контрактуры. В клинической практике наиболее часто среди них исследуются следующие:

-Ригидность затылочных мышц – один из ранних и наиболее постоянных менингеальных симптомов. При появлении этого феномена не удается пассивно пригнуть голову больного к груди из-за напряжения мышц, разгибающих шею.

-Ригидность длинных мышц спины – напряжение мышц приводит к тому, что больной изогнут кзади и не может разогнуться. В сочетании с напряжением мышц затылка в положении лежа на боку создается «поза легавой собаки» или «поза взведенного курка»: голова запрокинута назад, туловище максимально разогнуто, ноги приведены к животу, живот ладьевидно втянут. Эта поза, называемая также менингитической, встречается при тяжелом течении менингита.

5

-Симптом Кернига – невозможность разогнуть ногу больного в коленном суставе, когда она согнута в тазобедренном. При этом мешает разгибанию не боль, а напряжение задней группы мышц бедра.

-Верхний симптом Брудзинского – при пассивном сгибании головы больного происходит рефлекторное сгибание ног в коленных и тазобедренных суставах.

-Средний симптом Брудзинского – такое же рефлекторное сгибание ног при надавливании на лонное сочленение больного.

-Нижний симптом Брудзинского – рефлекторное сгибание ноги в коленном

итазобедренном суставах при пассивном сгибании другой ноги в этих же суставах.

-Подскуловой симптом Брудзинского – рефлекторное поднятие плеч и сгибание предплечий при надавливании непосредственно под скулами. Вследствие своеобразной позы этот симптом называют также симптомом «креста».

-Симптом Гийена – сдавливание четырехглавой мышцы бедра, с одной стороны, приводит к непроизвольному сгибанию в тазобедренном и коленном суставах противоположной ноги.

-Симптом Гордона – при сдавливании икроножной мышцы происходит рефлекторное разгибание большого пальца стопы.

-Симптом Германа – при пассивном сгибании головы происходит экстензия больших пальцев стоп.

Кроме указанных симптомов, в детской неврологической практике (у грудных детей) наблюдается напряжение и выпячивание родничка и «арбузный» звук при перкуссии черепа. Симптом «подвешивания» Лесажа выявляется у новорожденных и грудных детей – ребенка берут на руки за подмышечные впадины и приподнимают, что ведет к непроизвольному подтягиванию ножек к животу за счет сгибания их в тазобедренных и коленных суставах и длительной фиксации их в этом положении. У здорового ребенка при пробе Лесажа ножки свободно двигаются (сгибаются и разгибаются).

При формировании менингоэнцефалита у больного наблюдается развитие дополнительного симптомокомплекса – синдрома очаговой неврологической симптоматики, клинические проявления которого зависят от места локализации очага поражения ткани головного мозга, его объема и патологоанатомических характеристик.

Синдром воспалительных изменений ЦСЖ играет ведущую роль в установлении диагноза менингита. При менингитах отмечается значительное повышение давления ликвора (свыше 200 мм вод. ст.). Обязательно учитывают прозрачность и цвет ликвора. При серозных менингитах ЦСЖ как правило прозрачная, слегка опалесцирует, при гнойных – мутная желтовато-зеленого цвета. Цитологическое исследование ликвора обнаруживает значительное повышение количества клеток в нем (плеоцитоз). При гнойных менингитах преобладают нейтрофилы (40–100%), а при серозных – лимфоциты (40–60%). Также отмечается увеличение содержания белка (более выражено при гнойных бактериальных менингитах). Содержание сахара при гнойных бактериальных менингитах обычно понижено, при вирусных – в пределах нормы или понижено (например,

6

при туберкулезном менингите). Кроме этого, при формировании воспалительного процесса в оболочках головного мозга, в ликворе возможно возникновение так называемых синдромов диссоциации. Клеточно-белковая диссоциация характеризуется существенным повышением количества клеточных элементов в ЦСЖ на фоне нормального или умеренного повышения количества белка. Она характерная для многих бактериальных менингитов (менингоэнцефалитов). Белково-клеточная диссоциация характеризуется значительным повышением общего белка при умеренном плеоцитозе. Встречается при тяжелом течении менингита (менингоэнцефалита).

СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИИ ГЕМАТОЭНЦЕФАЛИЧЕСКОГО БАРЬЕРА

Учитывая значимую роль в развитии бактериальных менингитов (менингоэнцефалитов) гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), зачастую возникает необходимость оценки нарушения его функций. В настоящее время ГЭБ рассматривается в качестве сложного саморегулирующегося морфофункционального объединения, регулирующего поступление в головной мозг определенных веществ и выведение других для обеспечения нормальных метаболических процессов нервных клеток. Установлено, что ГЭБ обладает двумя тесно связанными между собой функциями – защитной и регуляторной. Защитная функция направлена на недопущение проникновения в ткани головного мозга и воздействия на них веществ, чужеродных центральной нервной системе. В основе регуляторной функции находится физиологически адекватная проницаемость, способствующая проникновению только тех веществ и только тех концентрациях, которые необходимы в данный момент времени для нормального полноценного функционирования клеток центральной нервной системы (ЦНС). В рамках ГЭБ выделяют несколько барьерных образований: собственно гематоэнцефалический барьер, гематоликворный барьер, а также ликвороэнцефалический барьер.

Значительную роль в осуществлении функций ГЭБ играют капилляры головного мозга, имеющие определенные особенности. К ним относятся следующие:

1.Стенка не обладает перфорациями и фенестрациями;

2.Эндотелиоциты связаны плотными контактами;

3.Крайне низкое количество пиноцитозных пузырьков в цитоплазме эндотелиоцитов;

4.Большое количество митохондрий в эндотелиоцитах капилляров;

5.Наличие сплошной базальной мембраны вокруг эндотелиального капиллярного канала;

6.Астроцитарная муфта, окружающая капилляр на всем протяжении.

Кроме эндотелиоцитов капилляров, к структурным элементам ГЭБ также относятся их базальная мембрана, астроцитарная муфта, эпиндимная глия и ее базальная оболочка, поверхностная и субэпиндемальная глиальные мембраны, сосудистые сплетения желудочков мозга, элементы мягкой мозговой оболочки, арахноидальная оболочка, синусы твердой мозговой оболочки. Схематическая структура орагнизации ГЭБ отображена на рисунке 1.

7

Кровь в мозговых капиллярах

Рис. 1. Схематическое изображение гематоэнцефалического барьера (по Куффлеру С., Николсу Дж., 1979).

В качестве методов оценки состояния ГЭБ используются так называемые индексы (коэффициенты) проницаемости, характеризующие возможность проникновения тех или иных веществ из сыворотки крови в ЦСЖ. В качестве оценки защитной функции ГЭБ используется индекс проницаемости альбуминов, поскольку данные белки не вырабатываются в ЦНС и попадают в нее вследствие проникновения через барьер. Его увеличение свидетельствует о нарушении защитной функции ГЭБ.

(норма 2,4–5,0)

Для оценки регуляторной функции используются индексы проницаемости по конкретному химическому веществу (метаболиту), например:

Клинико-лабораторное исследование ликвора

Взятие клинического материала

Отбор ликвора производят с соблюдением всех правил асептики и антисептики в условиях процедурного кабинета, перевязочной или операционной посредством люмбальной пункции в положении лежа на боку по стандартной методике. Реже используют субокципитальную пункцию и получение вентрикулярного ликвора во время операции. Весьма желательным является взятие проб ЦСЖ до начала антибактериальной терапии. Наиболее рациональным является исследование парных проб ликвора и сыворотки крови.

Количество ликвора, взятого посредством люмбальной пункции составляет 2–3 мл – у новорожденных, 5–7 мл – у детей иных возрастных групп и 8– 10 мл – у взрослых. Первые 3–5 капель ликвора удаляют, что позволяет избавиться от «путевой» крови, попадающей в первую порцию ликвора в результате повреждения кровеносных сосудов по ходу пункционной иглы. Затем собирают три порции (как исключение две) в стерильные пробирки, каждую их которых маркируют, указывая порядковый номер. На выполнение общеклинического и цитологического исследования необходимо не менее 1 мл, до 1мл расходуется на проведение биохимического исследования, остальное количество используют для микробиологических методов. Параллельно производят взятие крови посредством пункции вены в области локтевой ямки. Из них 0,5–1 мл идет на оценку воспалительных изменений, остальное количество используется для микробиологической диагностики. Пробирки с образами полученной крови и ликвора маркируются с указанием фамилии, имени отчества больного, даты проведения пункции, номера истории болезни и/или палаты (отделения), предварительного клинического диагноза, а также фамилии врача, выполнившего пункцию.

Органолептические свойства ликвора

Прозрачность или степень помутнения ликвора (прозрачный, опалесцирующий, слегка мутноватый, мутный, резко мутный) определяют в проходящем дневном свете на черном фоне, сравнивая доставленный в пробирке ликвор с таким же количеством дистиллированной воды, налитой в такую же пробирку.

Фибриновая (фибринозная) пленка образуется в ликворе при большом содержании фибриногена и имеет вид нежной сеточки или пленки на стенках пробирки, мешочка, содержащего ликвор с клеточными элементами или желеобразного сгустка на дне пробирки. Процесс образования пленки начинается сразу после получения ликвора и его нельзя нарушать, встряхивая или переливая часть в другую пробирку. То есть для оценки образования фибриновой пленки необходима отдельная пробирка. Пленка может образоваться в интервале от непосредственно пункции, через 30 минут, 1 час и до 10–15 часов.

Цвет ликвора оценивают как бесцветный, сероватый, серовато-розоватый, розовый, оранжевый, желтоватый, желтый, кофейно-желтый, бурый, сравнивая с дистиллированной водой, налитой в аналогичную пробирку.

9