Нарушения микроциркуляции, тромбоз, воспаление Учебно-методические рекомендации

4.Суперсемейство иммуноглобулинов (ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, VCAM-1) –

группа молекул адгезии клеток, экспрессированных преимущественно на эндотелиоцитах, определяющих эмиграцию лейкоцитов в норме и их селективную эмиграцию в патологии.

Стадии эмиграции лейкоцитов [1]:

1.Роллинг – переход циркулирующих в крови лейкоцитов из осевого кровотока в пристеночный, первичное взаимодействие с эндотелиоцитами – «перекатывание» по эндотелиальному слою. Молекулы клеточной адгезии, обеспечивающие механизм роллинга: L-, Р- и Е-selectins.

2.Адгезия – прикрепление лейкоцита к мембране эндотелицита с прочной фиксацией на стенке кровеносного сосуда. Молекулы клеточной адгезии, обеспечивающие механизм адгезии: ICAM-1, VCAM-1, β1-, β2-integrins.

3.Агрегация – аккумулирование пристеночного пула лейкоцитов. Молекулы клеточной адгезии, обеспечивающие механизм адгезии: P-selectin, CD11a/CD18, CD11b/CD18.

4.Собственно эмиграция, диапедез – выход лейкоцитов в интерстициальное пространство через слои стенки кровеносного сосуда. Молекулы клеточной адгезии, обеспечивающие механизмы эмиграции: PECAM-1, ICAM-1, VCAM-1,

β2-integrins.

Эмиграция завершается выходом лейкоцита в интерстициальное пространство и переходит в стадию миграции – активного амебоидного перемещения лейкоцита в толще тканей в очаг воспаления по градиенту хемоаттрактирующих веществ. По сути, миграция – это первая стадия процесса фагоцитоза (хемотаксис).

Фагоцитоз – процесс активного захвата и деструкции экзогенных объектов

исобственных поврежденных/стареющих клеток и их фрагментов фагоцитами (лейкоцитами, микрофагами). Явление фагоцитоза, филогенетически древнего, высокоэффективного механизма иммунитета, было открыто великим русским исследователем, нобелевским лауреатом И.И. Мечниковым.

Стадии фагоцитоза:

1.Приближение (хемотаксис) – направленное движение фагоцита в направлении фагоцитрируемого объекта по градиенту концентрации хемоаттрактантов. Помимо хемотаксиса ряд исследователей выделяют хемокинез – ненаправленное, хаотическое движение фагоцита вследствие его активации медиаторами воспаления.

2.Распознавание объекта и адгезия – рецепторный и/или электростатический процесс непосредственного контакта мембраны фагоцита(ов) с фагоцитируемым объектом, связанный с распознаванием доступных, поверхностных детерминант объекта-мишени рецепторами фагоцитов и приводящий к активации метаболических процессов в фагоците(ах).

3.Поглощение объекта – динамичный, стадийный процесс перевода объек- та-мишени в цитоплазму фагоцита, его полное окружение фагосомой, созданной путём инвагинации и замыкания участка клеточной мембраны.

4.«Переваривание» - биодеградация объекта – кислород-зависимые (сво-

бодные радикалы, галогенизация) и кислород-независимые (протеолитические

20

ферменты, катионные белки, лактоферрин, лизоцим) механизмы разрушения объекта при слиянии фагосомы с лизосомами и вакуолями фагоцита.

Фагоцит способен полностью утилизировать объект или после процессинга ассоциировать его фрагменты с белками главного комплекса гистосовместимости и презентировать такой антиген-содержащий комплекс на своей мембране. Иногда часть разрушенных фрагментов фагоцитированного материала выделяются в окружающую среду, иногда объект целиком или в фрагментированном виде сохраняется фагоцитом в своей цитоплазме. Деградация объекта возможна

ивнеклеточным способом, без перевода его в цитоплазму фагоцита. Это характерно для взаимодействия фагоцита с крупными объектами, превышающими его по размеру. При этом происходит экзоцитоз содержимого гранул с их «изливанием» на объект фагоцитоза – непосредственное повреждение объекта, снижение его функциональной активности и привлечение в эту область большого количества других фагоцитов. Существенным минусом такого способа является неизбирательное повреждение всех близлежащих клеточных структур

иинтерстициального матрикса.

Роль клеток-эффекторов воспаления в развитии воспалительного процесса

Нейтрофилы (полиморфноядерные нейтрофильные гранулоциты) –

группа гранулоцитов, окрашивающихся при стандартных гистологических методах как кислыми, так и основными красителями и составляющих в норме 45 – 75% всего пула лейкоцитов в периферической крови. Фагоцитоз – одна из главных функций нейтрофилов. Высокая численность нейтрофильных гранулоцитов, быстрое перемещение в очаг воспаления и их фагоцитарная активность формируют мощный, высокоэффективный, эволюционно апробированный противоинфекционный барьер организма. Нейтрофилы способны продуцировать значительное число медиаторов воспаления, ферментов, протеинов острой фазы и цитокинов, оказывающих влияние на все компоненты воспаления (свободные радикалы, протеолитические ферменты, фосфолипаза, катионные протеины, лизоцим, IL8, TNF-α) и позволяющих им взаимодействовать с другими клетками-эффекторами воспалительного процесса (макрофагами любого происхождения, лимфоцитами, эндотелиоцитами).

Эозинофилы (полиморфноядерные эозинофильные гранулоциты) – группа гранулоцитов, окрашивающихся при стандартных гистологических методах кислыми красителями и практически не способных воспринимать основную окраску. Классические эффекторы аллергических реакций и противопаразитарного ответа. Производят элиминацию медиаторов воспаления и биологически активных соединений, обеспечивая стихание воспалительных процессов. Эозинофилы, помимо медиаторов воспаления и регуляторных цитокинов, синтезируют большое количество уникальных веществ, характерных только для этих клеток и, в основном, имеющих противопаразитарный эффект: эозинофильный основной протеин, эозинофильный катионный протеин, эозинофильный нейротоксин и др.

21

Базофилы (полиморфноядерные базофильные гранулоциты) и мастоци-

ты (тучные клетки). Базофилы – группа гранулоцитов, окрашивающихся при стандартных гистологических методах кислыми красителями и практически не способных воспринимать основную окраску. Цитоплазма базофилов перенасыщена гранулами, зачастую препятствующими рассмотрению ядра этих клеток при световой микроскопии. Мастоциты – группа клеток костномозгового происхождения, ассоциированных с соединительной тканью (соединительнот-

канные мастоциты) и слизистыми оболочками органов (слизистые мастоци-

ты), контактирующих с окружающей средой (ЖКТ, дыхательная и мочевыделительная системы). Мастоциты располагаются преимущественно в периваскулярной и периневральной зонах и являются центральными клетками аллергических реакций немедленного типа; мембрана содержит большое количество рецепторов к реагиновым антителам, соединение с которыми вызывает дегрануляцию клеток с выбросом содержимого гранул.

Объединение базофилов и мастоцитов в одну группу носит искусственный характер и обусловлено сходством функций в воспалительном процессе. Клетки обеспечивают развитие воспалительных и аллергических реакций за счет наличия на мембранах большого количества рецепторов к реагиновым антителам (IgE), секрецией соединений, обладающих провоспалительной активностью (гистамин, гликозаминогликаны, простогландины/лейкотриены, активаторы и хемоаттрактанты эозинофилов, цитокины, фактор активации тромбоцитов и пр.) и вызывающих вазодилятацию, усиление кровоснабжения тканей и проницаемости сосудистой стенки, активацию ангиогенеза и привлечение в область дегрануляции эозинофилов и других лейкоцитов.

Моноциты – группа агранулоцитов периферической крови, содержащих несегментированное бобовидное ядро. Эмигрирующие из кровеносной системы моноциты пополняют пул макрофагальных клеток. Макрофаги, помимо высокой фагоцитарной активности – основного вида их деятельности, обладают способностью регулировать активность воспалительных и иммунных процессов, усиливать/ослаблять работу гемостатических механизмов посредством продукции цитокинов (IL-1, IL-6, IL-8, TNFα, колониестимулирующие факторы), медиаторов воспаления (медиаторы арахидоновой кислоты, свободные радикалы, гидролазы, катионные белки, факторы системы свертывания) и протеолитических ферментов (MMPs, коллагеназа, эластаза) [2]. Макрофаги – основные клетки, обеспечивающие физиологический механизм элиминации циркулирующих иммунных комплексов.

Лимфоциты – группа агранулоцитов, содержащих округлое, занимающее большую часть объема клетки, ядро. Лимфоциты – основные эффекторы иммунной системы (см. глава «Патофизиология иммунной системы») и одни из главных эффекторов хронического воспаления. По морфологическим и функциональным признакам различают Т-, B- и NK лимфоциты.

Экссудация – комплекс процессов избыточного выхода (или недостаточного возвращения) плазмы крови из просвета кровеносного сосуда в интерстициальное пространство и эмиграции и миграции лейкоцитов. Результатом является «перенаполнение» периваскулярных участков тканей экссудатом (совокуп-

22

ность компонентов плазмы крови и форменных элементов) с формированием отека, отграничением зоны воспалительных изменений от участков неизмененной ткани и лейкоцитарной инфильтрацией воспалительного очага.

В зависимости от биохимического и морфологического состава различают следующие типы экссудатов: серозные, фибринозные, геморрагические, гнойные, гнилостные и смешанные.

Экссудат следует отличать от транссудата – избыточного накопления в интерстициальном пространстве плазменного компонента крови, практически лишенного форменных элементов и крупномолекулярных протеинов. Транссудат является следствием смещения точки равновесия механизма Старлинга (см. главу «Патофизиология микроциркуляции») в сторону усиления выхода плазмы в артериальной области капилляров из внутрисосудистого пространства в интерстициальное и снижения ее возврата в венозной области капилляров при увеличении гидростатического давления в микроциркуляторном русле (первичные и вторичные артериальные гипертензии, пассивная гиперемия различной этиологии) или снижении онкотического давления плазмы крови (гипопротеинемия при нефротическом синдроме, голодные отеки).

Экссудативный компонент воспаления тесно связан со стадийными струк- турно-функциональными изменениями микроциркуляторного русла. Первоначально, вследствие непосредственного воздействия флогогенного агента на элементы сосудистой стенки (гладкомышечные клетки, эндотелий), периваскулярную зону, нервные центры, волокна и окончания происходит кратковременный спазм кровеносных сосудов с развитием ишемии области повреждения.

Вторая стадия сосудистых изменений – активная гиперемия – развивается после инактивации гуморальных факторов вазоконстрикции и ослабления нервных стимулов и протекает преимущественно по гуморальному («миопаралитическому») механизму. Биологический смысл активной гиперемии заключается в резком ускорении метаболических процессов в очаге воспаления и рядом расположенных областях, в массивном притоке клеточных и гуморальных эффекторов воспаления в зону повреждения.

Лавинообразное увеличение концентрации медиаторов воспаления приводит к прогрессивному замедлению скорости кровотока с переходом активной гиперемии в пассивную форму. Это явление связано с нарастающей активацией клеток-эффекторов воспалительного процесса (лейкоцитов, эндотелиоцитов, мастоцитов, тромбоцитов) и компонентов системы гемостаза. Происходит изменение физико-химических свойств крови и мембран форменных элементов и эндотелиоцитов с переходом ламинарного тока крови в турбулентный с параллельным развитием процесса тромбообразования в зоне поражения.

Тромбоз более выражен в венозной части кровеносного русла в силу струк- турно-функциональных особенностей эндотелия этой зоны по сравнению с артериальной областью. Дополнительно, замедлению тока крови способствует увеличение проницаемости кровеносных сосудов, развитие отека периваскулярной области со сдавливанием сосудов извне.

Прогрессирование пассивной гиперемии приводит к формированию стаза крови в очаге воспаления. Прекращение притока и выхода крови в области оча-

23

га поражения с одной стороны способствует развитию гипоксии и усилению альтеративных процессов, а с другой стороны создает необходимые предпосылки для формирования прочного барьера между очагом воспаления и неизмененными тканями организма. Барьерную функцию воспаления, помимо ограничения перемещения жидкости в очаге повреждения, создают пролиферативные механизмы.

Персистирование флогогенного агента, массивное разрушение тканей организма и нарушение барьерных функций воспаления способствуют развитию

синдрома системной воспалительной реакции (SIRS).

Системные проявления воспаления – лихорадка, анорексия, усиление гемопоэза, активация гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы и т.д., развиваются вследствие интенсивного синтеза цитокинов (TNF, IL-1,6 и др.) активированными клетками или при нарушении барьерной функции воспаления.

Пролиферация – завершающий компонент процесса воспаления, заключающийся в восстановлении (полном или частичном) структурнофункциональной целостности органа/ткани за счет размножения клеток (паренхиматозных и стромальных) и синтеза межклеточного вещества. Пролиферация начинается на периферических участках очага воспаления, в зоне, где слабее выражено действие клеточных и гуморальных эффекторов воспаления и происходит интенсивный синтез противовоспалительных медиаторов, ингибирующих механизмы альтерации и экссудации.

В развитии пролиферации можно выделить несколько стадий (звеньев):

1.Действие противовоспалительных гуморальных факторов (ингибиторы протеаз, антикоагулянты, антигипоксанты, антиоксиданты);

2.Активация пролиферации паренхиматозных клеток и фибробластов (EGF, VEGF, FAF, PGF, белки, ингибиторы каспазного цикла (IAPs), соматотропный гормон);

3.Активация синтеза межклеточного вещества и ангиогенеза (MMPs, VEGF, PGF, интегрины и другие молекулы клеточной адгезии);

4.Собственно восстановительные процессы, завершающие процесс воспаления (при остром воспалении) или стадию обострения (при хроническом воспалении).

По патогенезу и характеру развития воспалительного процесса различают

острое и хроническое воспаление.

Острое воспаление – эволюционно выработанный механизм первичного ответа защитных систем организма на повреждение, вызванное флогогенным агентом. Острое воспаление включает в себя все рассмотренные компоненты и завершается одним из трех сценариев:

1.Полное восстановление поврежденных органов и тканей: регенерация – восполнение дефекта клетками характерными для данной ткани (типично для быстрообновляемых тканей), фиброзирование – восполнение дефекта преимущественно за счет разрастания соединительной ткани (типично для медленнообновляемых тканей и для участков с резко нарушенным кровоснабжением).

24

2.Неполное восстановление функциональной активности поврежденных органов и тканей с полным прекращением процессов воспаления (значительные структурные перестройки органа/ткани при фиброзировании).

3.Переход острого воспаления в хроническую форму.

4.Гибель организма.

Хроническое воспаление – эволюционно выработанный механизм локализации, отграничения от неизмененных тканей, элиминации флогогенных агентов, способных ускользать от деструктивного действия эффекторов воспаления и персистировать в организме. Для течения хронического воспаление характерно чередование «волн» активации процесса (обострение) и его затухания (ремиссия).

Морфологически хроническое воспаление характеризуется выраженной лейкоцитарной инфильтрацией пораженных тканей (преимущественно моноцитар- но-лимфоцитарной), деструктивными изменениями органа (развитие фиброза, участки некротических изменений, нарушение формы и взаимодействия с другими органами/тканями).

Становится понятным механизм противовоспалительного действия голюкокортикоидов – блокаторов активности фосфолипазы А2 (через специфиче-

скую стимуляцию синтеза моноцитами липокортинов).

Цель занятия:

1.Исследовать особенности сосудистых изменений при развитии воспале-

ния.

2.Исследовать особенности фагоцитоза макрофагами.

3.Демонстрация учебного видеофильма «Роль лейкоцитов в развитии воспаления».

Опыт №1. Моделирование сосудистых изменений при развитии воспаления в брыжейке лягушки.

Подготовку препарата лабораторной лягушки осуществляют в соответствии с ранее описанной методикой (см. глава «Тромбоз», опыт №1).

Производят разрез боковой поверхности живота лягушки, осторожно извлекают из брюшной полости петли тонкой кишки, расправляют над круглым отверстием брыжейку, фиксируют ее к препаровальному столику булавками и дают немного подсохнуть для инициации воспалительных изменений; помещают подготовленный объект на предметный столик микроскопа.

Производят обзорную микроскопию брыжейки лягушки, наблюдают нормальную работу системы микроциркуляции. По мере высыхания препарата наблюдают стадийное развитие изменений в области микроциркуляторного русла, начальные стадии эмиграции лейкоцитов.

В протокол опыта заносят изменения кровообращения в микроциркуляторном русле и изображение маргинации лейкоцитов в кровеносном русле. Вывод должен отражать заключение о механизмах исследованных явлений.

25

Опыт №2. Микроскопическое исследование особенностей фагоцитоза – фагоцитоз птичьих эритроцитов в асептическом экссудате (опыт Мечникова).

Производят исследование методом световой микроскопии коллекции препаратов кафедры патологической физиологии ГБОУ ВПО СПбГПМУ по теме «Фагоцитоз».

Основой препарата является экссудат перитонеальной полости крысы, в которую за 40–50 минут до взятия материала ввели взвесь птичьих эритроцитов.

Для наблюдения за процессом фагоцитоза вызывается асептическое воспаление в брюшной полости крысы. С этой целью животному интраперитонеально вводится 5 мл 10% стерильного мясопептонного бульона. Через 24–48 ч., когда в перитонеальном экссудате появится достаточное количество макрофагов, в брюшную полость крысы двукратно (с интервалом в 15 минут) вводят взвесь птичьих эритроцитов - как объект фагоцитоза. Двукратное введение эритроцитов позволяет в одном препарате видеть различные фазы фагоцитоза. Полученный экссудат изучается в висячей капле и в окрашенных мазках.

а) Изучение фагоцитоза в нативном перитонеальном экссудате в висячей капле. Смазав по краям покровное стекло тонким слоем вазелина, на середину его наносят маленькую каплю 1% р-ра нейтральрот в физиологическом растворе и прибавляют туда же капельку полученного экссудата. Нейтральрот – индикатор, принимающий в кислой среде красный цвет, следовательно можно ожидать, что розовый цвет приобретет цитоплазма тех макрофагов, где уже идут процессы переваривания фагоцитированных клеток, под действием ферментов макрофага.

Покровное стекло накрывается предметным стеклом с лункой так, чтобы капля пришлась на середину углубления. Предметное стекло слегка прижимается к покровному и препарат переворачивают покровным стеклом вверх. Хорошо приготовленная висячная капля не должна касаться предметного стекла. Приготовленный препарат просматривают под микроскопом. Рассматривая препарат под малым увеличением, среди массы желтоватых эритроцитов находят красноватые комочки - макрофаги крыс, у которых уже идут процессы фагоцитоза. Поставив комочек в центр поля зрения, надо подвергнуть его подробному рассмотрению под большим увеличением, при этом можно наблюдать все стадии фагоцитоза гусиных эритроцитов макрофагами. Обращают внимание на окраску гусиных эритроцитов в стадии прилипания, в стадии захвата и в стадии переваривания их макрофагами крысы.

б) Изучение фагоцитоза в окрашенном препарате. Приготовление и окраска фиксированного мазка. Приготовление мазков начинают после того как при просматривании висячей капли под малым увеличением убеждаются в наличии фагоцитоза (красные комочки среди желтоватых эритроцитов).

Пастеровской пипеткой на предметное стекло наносится экссудат и шлифованным стеклом делается мазок (не слишком тонкий). Он тщательно высушивается на воздухе и окрашивается краской Май-Грюнвальд. Зарисовать все стадии фагоцитоза.

26

Опыт №3. Демонстрация учебного видеофильма «Роль лейкоцитов в развитии воспаления».

Литература

1.Stevens, J.S. Lowe, I. Scott Core Pathology, 3rd Edition with STUDENT CONSULT Online Acces, 2009, Elsrvier Limited.

2.Rubin Е., Gorstein F et al. Rubin’s pathology: clinicopathologic foundations of medicine / editor-in-chief, E. Rubin. 4-th ed. 2004.

3.Зайчик А.Ш., Чурилов Л.П. Общая патофизиология (с основами иммунопатологии). Учебник для студентов медВУЗов. – СПб.: 2005. – ЭЛБИ-СПб, 656 с., илл.

27