Биофизика клетки методические указания

Министерство сельского хозяйства Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Самарский государственный аграрный университет»

В. В. ЕРМАКОВ

БИОФИЗИКА КЛЕТКИ

Методические указания

Кинель РИО СамГАУ

2019

1

УДК 579.6 : 579.62 : 579.63 : 579.26

ББК 48.41 Р Е72

Ермаков, В. В.

Е72 Биофизика клетки : методические указания / В. В. Ермаков. – Кинель : РИО СамГАУ, 2019. – 28 с.

В методических указаниях приведены материалы об основных методах исследования проницаемости биологических мембран, транспорта веществ через мембраны, электрогенеза в клетках, изучения свойств биопотенциала действия в клетке, модели фильтрационно-реабсорбционных процессов в капиллярах, применения спектрофотометрии в биологических исследованиях.

Методические указания предназначены для студентов сельскохозяйственных и биологических вузов, обучающихся по направлению подготовки 06.03.01 «Биология».

©ФГОБУ ВО Самарский ГАУ, 2019

©Ермаков В. В., 2019

2

ПРЕДИСЛОВИЕ

В методических указаниях приведён цикл занятий для изучения основных методов исследования проницаемости биологических мембран, транспорта веществ через мембраны, электрогенеза в клетках, изучения свойств биопотенциала действия в клетке, модели фильтрационно-реабсорбционных процессов в капиллярах, применения спектрофотометрии в биологических исследованиях.

Цель написания методических указаний – обеспечение сту-

дентов методикой работы и фиксирования результатов работы на лабораторных и парактических занятиях с биологическими мембранами, клетками тканей организма животного, с экспериментальными биологическими объектами.

Процесс изучения дисциплины «Биофизика клеки» направлен на формирование у студентов компетенции, связанной со способностью применять знание принципов клеточной организации биологических объектов, биофизических и биохимических основ, мембранных процессов и молекулярных механизмов жизнедеятельности.

3

Занятие 1. Исследование проницаемости модельных мембран

Цель занятия. Изучить основные методы исследования проницаемости модельных биологических мембран.

Биохимические методы исследования биомембран позволяют выделять в чистом виде отдельные компоненты мембран, анализировать их физико-химические свойства, пути биосинтеза и распада компонентов, влияние на метаболизм физико-химических факторов внутренней и внешней среды.

Физиологические методы позволяют исследовать различные функции на естественных и искусственных мембранах (кожи, передней брюшной стенке лягушки, стенке мочевого пузыря мелких животных, стенке кишечника животных). Данные методы позволяют изучять проницаемость мембран для атомов, ионов, процессы, проходящие в биомембранах в ходе возбуждения, торможения, проведения нервного импульса.

Генетические методы исследования мембран основаны на применении мутантов, имеющих дефекты по синтезу определенных мембранных белков, что позволяет изучить, например, роль данных молекул белка в надмолекулярной организации и изменении функций мембран.

Иммунологические методы исследования мембран позволяют использовать их в виде антигенов для идентификации специфических участков мембран, выделения комплексов антиген-антитела в ходе иммунобиологических исследований.

Биофизические методы исследования биологических мембран предоставляют возможность выявить структуру и функции самих мембран, а также получить информацию о изменении физикохимических параметов мембран в зависимости от функционального состояния их. В группу биофизических методов входят метод электронной микроскопии, метод электронного парамагнитного резонанса при использовании специальных меток, метод ядерного магнитного резонанса, метод флуоресцентной спектроскопии при использовании флуоресцентных зондов, метод определения дисперсии оптического вращения, метод дифференциальной сканирующей калориметрии, метод рентгеновского рассеяния нейтронов, метод искусственных мембран, метод радиоактивных изотопов.

4

Методы рентгеновской дифракции (рентгеноструктурный анализ) и дифракции нейтронов основаны на взаимодействии электромагнитного излучения различной длины волны или частиц с определенной длинной волны, сопоставимой с межатомным расстоянием и компонентами самой мембраны. Эти методы используют с целью определения геометрических параметров структуры мембраны, например, при анализе толщины биологического слоя, выявления расстояния между углеводородными цепями.

Метод ядерного магнитного резонанса основан на явлении резкого возрастания поглощения энергии электромагнитной волной системой атомных ядер, обладающих магнитным потенциалом, размещенных во внешнем магнитном поле. Этот метод дает возможность изучить подвижность молекул липидов биомембраны, расположение фосфолипидных молекул в биослое. Метод электронного парамагнитного резонанса основан на введении в

липидный биослой парамагнитных меток и зондов. За счёт использования методов ядерного магнитного резонанса и электронного парамагнитного резонанса были изучены такие явления как латеральная диффузия и «флип-флоп». Латеральная диффузия представляет собой хаотическое тепловое перемещение молекл липидов и белков в плоскости мембраны. Явление «флип-флоп» представляет собой диффузию молекул мембранных фосфолипидов поперек мембраны. Скорость перемещения молекул с одной поверхности мембраны на другую («флип-флоп») определена методом меченых меток в опытах на модельных липидных мембранах – липосомах.

Задание 1. Описать группу методов исследования проницаемости модельных мембран.

Задание 2. Описать методы ядерного магнитного резонанса и электронного парамагнитного резонанса.

Контрольные вопросы

1.С какой целью применяют биохимические методы?

2.С какой целью применяют физиологические методы?

3.Для чего применяют генетические методы?

4.С какой целью применяют иммунологические методы?

5.Для чего применяют биофизические методы?

5

Занятие 2. Исследование проницаемости модельных мембран

Цель занятия. Изучить проницаемость модельных биологических мембран – липосом.

Исследование проницаемости биологических мембран имеет большое значение для медицины и фармации. Перенос веществ через клеточные мембраны является важнейшим условием жизнедеятельности клетки. В настоящее время многие болезни связаны с нарушением переноса веществ через мембраны.

Эффективность фармацевтических средств напрямую зависит от их способности проникнуть в клетки, то есть, от проницаемости биологических мембран для лекарственных веществ.

Структурной основой биологических мембран является фосфолипидный биослой. Большое значение для жизнедеятельности клетки имеет селективная (избирательная) проницаемость липидного биослоя.

Важную информацию о проницаемости липидной фазы биологических мембран предоставляют исследования модельных мембран – липосом. Липосомы широко применяются не только как модельные объекты в различных исследованиях, но и имеют практическое применение, например, практикуется введение в организм лекарственных веществ, помещенных внутрь липосом.

Внастоящее время общепринятой является модель раствори- мо-мозаичного строения мембран. Данное название произошло, в следствие того, что около 30% липидов мембраны тесно связаны с внутренними белками, а остальное – находится в жидком состоянии, где «плавают» липопротеиды. В мембранах молекулы липидов размещены в виде двойного слоя, их полярные гидрофильные «головки» обращены к внешней и внутренней стороне мембраны,

агидрофобные неполярные «хвосты» обращены внутрь.

Врезультате этого, при осмотре на мембраны сверху она напоминает мозаику, созданную полярными «головками» липидов, поверхностными и внутренними белками. Толщина мембран варьирует в довольно широких пределах в зависимости от их типа. Мембраны клеток эукариот и прокариот сходны по строению.

Между молекулами белков или их частями часто существуют поры (канальцы), заполненные водой. Молекулы, входящие в состав мембран, способные перемещаться, благодаря чему мембраны

6

быстро возобновляются, незначительные повреждений, образующиеся над оголенными участками цитоплазмы, могут легко сливаться друг с другом, растягиваться и сжиматься, например, при движении клеток или изменения их формы.

Осмотический метод изучения проницаемости биологических мембран основан на наблюдении изменения объема клеток при помещении их в растворы исследуемых веществ. Осмос – преимущественное движение молекул растворителя через полупроницаемую мембрану (непроницаемую для растворенного вещества и проницаемую для растворителя) из мест с меньшей концентрацией растворенного вещества в места с большей концентрацией. Осмос играет большую роль во многих биологических явлениях. Осмос используется в терапии, например, действие некоторых сильных слабительных средств основано на создании в желудочном тракте повышенной концентрации растворенного вещества и осмоса в него воды. Клетки животных и растений содержат растворы солей и других осмотически активных веществ (для которых проницаемость биологической мембраны меньше, чем для воды). Если клетку поместить в гипотонический раствор, то объем клетки увеличивается за счет осмоса воды в клетку.

Турбидиметрия и нефелометрия – методы, основанные на изучении рассеяния света при прохождении его через исследуемую дисперсную среду. Нефелометрия дает возможность определять концентрацию, размер, форму диспергированных частиц в дисперсных системах. Турбидиметрия основана на измерении интенсивности прошедшего света, ослабленного вследствие рассеяния.

Задание 1. Описать осмотический метод.

Задание 2. Описать методы турбидиметрии и нефелометрии.

Контрольные вопросы

1.Значение исследования проницаемости биомембран.

2.Значение структурной основы биомембран.

3.Характеристика растворимо-мозаичного строения мембраны.

4.Характеристика осмотического метода.

5.Методы турбидиметрии и нефелометрии.

7

Занятие 3. Активный транспорт веществ через биологическую мембрану

Цель занятия. Изучить назначение и организацию мембранной системы активного транспорта на примере натрий-калиевого насоса.

Транспорт вещества, совершающийся с затратой энергии метаболических процессов называется активным переносом. Активный перенос и селективная проницаемость мембран приводит к неравномерному распределению ионов. Известно, что примерно 10% всей энергии, вырабатываемой эритроцитами, идет на поддержание неравномерного распределения катионов. Явление активного переноса веществ обнаружено у большинства клеток и тканей. Активный перенос осуществляется особыми ферментамипереносчиками – транспортными АТФ-азами (аденозинтрифосфотазами).

Существует три основные системы активного транспорта, обеспечивающие перенос ионов Na+, К+, Са+ и Н+ через биологические мембраны клетки, работающие за счет свободной энергии гидролиза АТФ. Большая роль в генерировании биоэлектрических потенциалов и проведении возбуждения принадлежит активному переносу ионов калия и натрия. В мембранах имеется один общий переносчик ионов калия и натрия. Данный механизм, называемый «натрий-калиевым насосом», в состоянии физиологического покоя клетки обеспечивает наличие двух встречных потоков ионов натрия и калия через мембрану. Три иона Na+, перенесенные из клетки, отщепляются у её наружной поверхности, и к переносчику присоединяется 2 иона калия, которые переносятся на внутреннюю поверхность мембраны. Среди всех АТФ-аз, имеющихся в клетке, решающее значение для транспорта ионов К+ и Na+ имеет АТФ-аза, активизируемая этими же ионами (Na+-К+-АТФ-аза) и ионами магния.

Перенос 2К+ внутрь клетки и выброс 3Na+ наружу приводит, в результате, к переносу одного положительного заряда из цитоплазмы в окружающую среду и появлению мембранного потенциала со знаком «плюс» на внешней поверхности мембраны и «минус» на внутренней. Таким образом, натрий-калиевый насос является электрогенным.

8

В переносе ионов калия и натрия участвуют также и липиды. В результате при переносе ионов Na+ и К+ происходит их химическое изменение. Превращение фосфолипидов в мембранах играет роль пускового механизма в процессе переноса Na+ через мембрану.

Активный перенос ионов действует наряду с активным переносом органических веществ, в частности сахаров, аминокислот и нуклиотидов. Известно, что перенос аминокислот и сахаров в тонком кишечнике, в проксимальном канальце нефронов почки, сопряжен с транспортом ионов Na+, и это сопряжение осуществляется непосредственно на переносчике. Как и при активном транспорте ионов, при активном транспорте органических веществ перенос осуществляется по градиенту концентрации и требует затраты энергии метаболических процессов клетки. В итоге образуется неравномерное распределение органических веществ между цитоплазмой и внешней средой.

Задание 1. Описать работу натрий-калиевого насоса. Задание 2. Описать активный перенос органических веществ.

Контрольные вопросы

1. Значение активного транспорта веществ.

2. Значение транспортных АТФ-аза в активном транспорте веществ.

3.Роль фосфолипидов в активном транспорте веществ.

4.Работа натрий-калиевого насоса.

5.Активный перенос органических веществ.

Занятие 4. Активный транспорт веществ через биологическую мембрану

Цель занятия. Изучить явление активного транспорта веществ на примере опыта Уссинга.

Наблюдение активного транспорта ионов натрия через кожу лягушки.

Существование активного транспорта веществ через биологические мембраны впервые было доказано в опытах Уссинга (1949 г.) на примере переноса ионов йатрия через кожу лягушки. Экспериментальная камера Уссинга, заполненная нормальным раствором Рингера, была разделена на две части свежеизолированной кожей лягушки. Слева находилась наружная мукозная

9

поверхность кожи, справа была внутренняя серозная. В опыте наблюдались потоки ионов натрия через кожу лягушки: слева направо от наружной к внутренней поверхности и справа налево от внутренней к наружной поверхности.

Врезультате, на коже лягушки, разделяющей раствор Рингера, возникает разность потенциалов: внутренняя сторона кожи имеет положительный потенциал по отношению к наружной. В установке Уссинга имелся блок компенсации напряжения, с помощью которого устанавливалась разность потенциалов на коже лягушки. В итоге, было установлено, что через кожу лягушки течет электрический ток, следовательно, происходит односторонний перенос заряженных частиц.

Вдальнейшем методом меченых атомов было доказано, что поток натрия через кожу лягушки по направлению внутрь больше потока, чем по направлению наружу.

Задание 1. Описать опыт Уссинга.

Задание 2. Обосновать явление активного транспорта ионов натрия через кожу лягушки.

Контрольные вопросы

1. Значение опыта Уссинга.

2.Ход опыта Уссинга.

3.Как проходит активный перенос ионов натрия через кожу лягушки?

4.Зачем в опыте Уссинга использовался раствор Рингера?

5.Как распологалась кожа лягушки в камере Уссинга?

Занятие 5. Электрогенез в клетках. Потенциал покоя, потенциал действия

Цель занятия. Изучить явление электрогенеза в клетках.

Важнейшая функция биологической мембраны – генерация и передача биопотенциалов. Данное явление лежит в основе возбудимости клеток, регуляции внутриклеточных процессов, работы нервной системы, регуляции мышечного сокращения, рецепции. В медицинской практике на исследовании электрических полей, созданных биопотенциалами органов и тканей, основаны диагностические и лечебные методы: электрокардиография, электроэнцефалография, электромиография и другие.

10