Иммунология методические указания по выполнению лабораторных работ для студентов специальности 36.05.01 Ветеринария

Таблица 4

Принцип метода. Разрушение эритроцитов барана при совместным действии комплемента и гемолизина, которое возможно при образовании комплекса антигенантитело.

Ход анализа.

1.Каждому студенту провести РСК с одной из предложенных сывороток животных.

2.Результаты РСК зафиксировать в тетради.

Оборудование и биологические объекты

1. Исследуемые сыворотки крови, разведѐнные 1:10 и инактивированные нагреванием.

2.Коммерческий антиген в разведении, указанном на флаконе.

3.Гемолизин в рабочем титре.

4.Комплемент сыворотки крови в соответствующем титре.

5.Физиологический раствор.

6.Взвесь отмытых эритроцитов барана в разведении 1:40 на физиологическом растворе.

7.Стеклянная посуда

8.Дозаторы объѐмом 0,1-1 мл.

9.Водяная баня

10.Штативы для пробирок.

ЛИТЕРАТУРА

1. Кисленко, В. Н. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии [Текст]: Учеб. пособие / В. Н. Кисленко – М.: КолосС, 2005. – 232 с.

11

ТЕМА 5. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РОЗБЕНГАЛ ПРОБЫ (РБП) И КОЛЬЦЕВОЙ РЕАКЦИИ С МОЛОКОМ (КР) ПРИ ДИАГНОСТИКЕ БРУЦЕЛЛЁЗА ЖИВОТНЫХ

Цель: техника постановки РБП

Реакцию ставят для качественного обнаружения бруцеллѐзных антител в крови исследуемого животного.

В лунку эмалированной пластины к капле сыворотки крови исследуемого животного добавляют каплю коммерческого роз-бенгал антигена, который представляет собой взвесь убитых и окрашенных в красный цвет бруцелл. Покачивают пластину круговыми движениями в течение 4 минут. Результат реакции оценивается в четырѐх крестовой системе по степени агглютинации:

«++++» - в виде большого количества крупных розовых хлопьев и полного просветления жидкости; «-» - осадка нет, жидкость мутная с розовым оттенком.

Результат реакции на «++++» и «+++» считают положительным.

Техника постановки КР с молоком

Реакцию ставят для качественного обнаружения бруцеллѐзных антител в молоке исследуемого животного.

В пробирку вносят 10 мл молока исследуемого животного и добавляют 0,5 мл коммерческого антигена, который представляет собой взвесь убитых и окрашенных гематоксилином бруцелл. Молоко с антигеном перемешивают до равномерного синего окрашивания и инкубируют при 37◦С 1 час. При наличии комплекса антиген-антитело последний увлекается жировыми шариками на поверхность, образуя здесь синее кольцо. Молоко при этом становится белым.

Принцип метода. Склеивание окрашенных бруцелл антителами сыворотки крови или молока больного животного.

Ход анализа.

1.Каждому студенту провести РБП с одной из предложенных сывороток животных.

2.Результаты РБП зафиксировать в тетради.

Оборудование и биологические объекты

1.Исследуемые сыворотки животных.

2.Бруцеллѐзный роз-бенгал антиген.

3.Эмалированные пластины.

4.Дозаторы объѐмом 0,1-1 мл.

5.Штатив для пробирок.

ЛИТЕРАТУРА

1. Кисленко, В. Н. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии [Текст]: Учеб. пособие / Кисленко, В. Н. – М.: КолосС, 2005. – 232 с.

12

ТЕМА 6. КОЛЬЦЕВАЯ РЕАКЦИИ ПРЕЦИПИТАЦИИ ПО АСКОЛИ (РКП)

Цель: приобретение навыков постановки и учета кольцевой реакции преципитации.

Опрос изученности учебного материала от прошлого занятия - 15 минут

Студентам предлагается теоретический материал необходимый для решения проблемы текущего занятия - 15 минут. Реакцию используют для качественного выявления антигена при помощи коммерческой преципитирующей гипериммунной сыворотки. В реакции преципитации (осаждения) используют высокодисперсный антиген, т.е. прозрачный раствор антигена, которым является фильтрат экстракта кожевенного сырья.

Техника постановки РКП

В узкую пробирку Уленгута вносят 0,4 мл коммерческой преципитирующей гипериммунной сыворотки, а затем осторожно по стенке пробирки наслаивают равное количество фильтрата экстракта из исследуемого материала. Учѐт реакции проводят через 1-2 минуты по образованию на границе между жидкостями белого кольца преципитации.

Параллельно ставят "+" и "-" контроли.

Формулировка проблемы - 1 минута. Требуется дать рекомендации по дальнейшему использованию партии кожи крупного рогатого скота, поступившей на кожевенный завод.

Разработка алгоритма решения проблемы - 5 минут. Необходимо определить заражѐнность возбудителем сибирской язвы нескольких проб кожи, отобранных с разных частей партии, серологическим методом. Зафиксировать результаты исследований в тетради. Объединить результаты исследований по всем пробам для дачи заключения о дальнейшем использовании партии.

Актуализация проблемы для студентов - 4 минуты. Студенты делятся на несколько групп. Каждой группе студентов предлагается дать рекомендации по заражѐнности одной пробы кожи. Затем результаты, полученные группами студентов, объединяются и даѐтся заключение по дальнейшему использованию партии кожи.

Проведение исследования - 30 минут. Поставить кольцевую реакцию преципитации с пробой кожи. Зафиксировать результаты исследований в тетрадь.

Результаты анализа сопоставляются с нормой - 5 минут. Дать заключение по безопасности данной пробы кожи.

Обобщение и систематизация полученных результатов - 5 минут. Необходимо обменяться данными по определению заражѐнности кожи с другими группами студентов и дать общее заключение по дальнейшему использованию партии кожи.

13

Подведение оценка работы студентов - 10 минут. Преподаватель просматривает записи студентов в тетрадях и оценивает активность отдельных студентов при проведении исследований.

Оборудование и биологические объекты

1.Диагностическая гипериммунная преципитирующая сыворотка.

2.Фильтраты экстрактов из исследуемого материала.

3.Пробирки Уленгута.

4.Дозаторы объѐмом 0,1-1 мл.

5.Штатив для пробирок.

ЛИТЕРАТУРА

1. Кисленко, В. Н. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии [Текст]: Учеб. пособие / В. Н. Кисленко. – М.: КолосС, 2005. – 232 с.

14

ТЕМА 7. РЕАКЦИЯ ДИФФУЗНОЙ ПРЕЦИПИТАЦИИ ПО ОУХТЕРЛОНИ (РДП)

Цель: техника постановки РДП

ВРДП исследуют фильтраты экстрактов проб патологического материала, например кожи, внутренних органов, на наличие в них антигена.

Вголодном агаре на чашке Петри металлическими пробойниками делают семь лунок диаметром 5 мм. На дно каждой лунки пипеткой вносят по одной капле расплавленного голодного агара, который после застывания формирует дно лунки и препятствует протеканию еѐ содержимого под слой агара. В центральную лунку вносят коммерческую преципитирующую сывротку, а в остальные лунки фильтраты

экстрактов исследуемых проб патологического материала. Чашку Петри, не переворачивая, инкубируют 1-2 суток в термостате при 37◦С во влажной камере.

Реакцию считают положительной при возникновении между центральной и периферийной лунками серой линии преципитации.

Параллельно ставят "+" и "-" контроли.

Принцип метода. Выпадение в осадок комплекса антиген-антитело.

Ход анализа.

1. Каждому студенту провести РДП с одним фильтратом экстракта из исследуемого

материала.

2. Результаты РДП зафиксировать в тетради.

Оборудование и биологические объекты

1.Диагностическая гипериммунная преципитирующая сыворотка.

2.Фильтраты экстрактов из исследуемого материала.

3.Чашки Петри с голодным агаром.

4.Пробирки с голодным агаром.

5.Дозаторы объѐмом 0,1-1 мл.

6.Пробойники.

7.Газовые горелки.

8.Влажная камера.

9.Термостат на при 37◦С.

10.Штатив для пробирок.

ЛИТЕРАТУРА

1. Кисленко, В. Н. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии [Текст]: Учеб. пособие / В. Н. Кисленко. – М.: КолосС, 2005. – 232 с.

15

ТЕМА 8. МЕТОД ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ АНТИТЕЛ (МФА)

Цель: техника постановки МФА

В МФА используют антитела, меченные флуоресцирующим красителем, который светится зелѐным светом под ультрафиолетовыми лучами. Метод используется для идентификации микробных клеток в мазках-отпечатках с патологического материала, в мазках из экссудата или микробной культуры.

На предметном стекле делают мазок из культуры микроорганизмов или мазокотпечаток с патологического материал. Подсушивают мазок на воздухе и фиксируют 15 минут в 96%-м этиловом спирте. На фиксированный подсушенный мазок наносят флуоресцирующие антитела на 20 минут при 37◦С в тѐмной влажной камере. Промывают препарат водой, подсушивают и просматривают масляной иммерсионной системой люминесцентного микроскопа.

Учѐт реакции. Результат реакции оценивается в четырѐх крестовой системе: «++++» - яркое свечение по периферии микробной клетки; «-» - отсутствие свечения микробных клеток.

Результат реакции на «++++» и «+++» считают положительными. Параллельно ставят "+" и "-" контроли.

Принцип метода. Выпадение в осадок комплекса антиген-антитело.

Ход анализа.

1.Каждому студенту провести МФА с одной культурой микроорганизмов.

2.Результаты МФА зафиксировать в тетради.

Оборудование и биологические объекты

1.Диагностическая флуоресцирующая сыворотка.

2.Взвеси культур микроорганизмов.

3.Дозаторы объѐмом 0,1-1 мл.

4.Люминисцентный микроскоп с масляной иммерсией.

5.Бактериологические петли.

6.Газовые горелки.

7.Влажная камера.

8.Оборудование для окрашивания мазков.

9.Штатив для пробирок.

10.Спирт.

ЛИТЕРАТУРА

1. Кисленко, В. Н. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии [Текст]: Учеб. пособие / В. Н. Кисленко. – М.: КолосС, 2005. – 232 с.

16

ТЕМА 9. ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ (ИФА)

Цель: техника постановки ИФА для обнаружения антител в сыворотки крови животного

Для обнаружения антител в сыворотке крови больного животного используют меченные ферментом антивидовые антитела. Антивидовые антитела, меченные ферментом, присоединяются к комплексу антитело + антиген, затем комплекс выявляется субстратом.

Вряд лунок пластиковой микроплашки вносят по 0.2 мл антигена, инкубируют 15 минут при 37◦С. Антиген адсорбируется на поверхности лунок. Затем лунки промывают фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБ), чтобы удалить избыток несорбированного на них антигена.

Не занятые антигеном участки поверхности лунки обрабатывают внесением в неѐ 0.3 мл 2%-го раствора сухого молока на 15 минут при 37◦С.

Вряд обработанных антигеном лунок вносят по 0.2 мл последовательных двух

кратных разведений исследуемой сыворотки в титрах с 1:100 до 1:204800, инкубируют 15 минут при 37◦С, затем промывают ФСБР, чтобы удалить несорбированные антитела.

Влунки вносят по 0.2 мл меченной ферментом антивидовой сыворотки, инкубируют 15 минут при 37◦С, затем отмывают ФСБР от не связавшихся антител.

Влунки вносят 0.2 мл раствора субстрата, инкубируют в темноте 15 минут при 20◦С, учитывают результат реакции по появлению окраски содержимого лунок.

Принцип метода. К комплексу антиген-антитело присоединяются меченные ферментом антивидовые антитела, которые выявляются по цветной реакции с субстратом.

Ход анализа.

1. Каждому студенту провести ИФА с одной сывороткой крови исследуемого животного.

2.Результаты ИФА зафиксировать в тетради.

Оборудование и биологические объекты

1.Исследуемые сыворотки животного.

2.Взвесь убитой культуры бактерий.

3.Меченная ферментом антивидовая сыворотка.

4.Раствор субстрата.

5.Дозаторы объѐмом 0,1-1 мл.

6.Пластиковые микроплашки

7.Шейкер с термостатом на 37◦С.

8.2%-й раствор сухого молока.

9.ФСБ.

ЛИТЕРАТУРА

1. Кисленко, В. Н. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии [Текст]: Учеб. пособие / В. Н. Кисленко. – М.: КолосС, 2005. – 232 с.

17

Тема 5. Использование розбенгал пробы (РБП) и кольцевой реакции с молоком

18