Иммунология методические указания по выполнению лабораторных работ для студентов специальности 36.05.01 Ветеринария

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФГОУ ВО «КАБАРДИНО-БАЛКАРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ.В.М.КОКОВА

ФАКУЛЬТЕТ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОТЕХНОЛОГИИ

кафедра ветеринарно-санитарной экспертизы

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

к выполнению лабораторных работ по дисциплине "Иммунология" для студентов специальности 36.05.01 «Ветеринария» всех форм обучения.

Нальчик -2017

Рекомендовано УМС ФГБОУ ВО "Кабардино-Балкарский ГАУ Протокол №__________

Автор: д.б.н., доцент кафедры «Ветеринарно-санитарная экспертиза» Ф.М. Хасаева.

Иммунология: методические указания по выполнению лабораторных работ для студентов специальности 36.05.01 "Ветеринария" / Сост.: Ф.М. Хасаева // ФГБОУ ВО "Кабардино-Балкарский ГАУ". – Нальчик, 2017. – 18 с.

Методические указания по выполнению лабораторных работ "Иммунология" составлены в соответствии с программой дисциплины и предназначены для студентов специальности 36.05.01 "Ветеринария". Методические указания по выполнению лабораторных работ содержат краткое описание лабораторных методов диагностики инфекционных заболеваний при помощи реакций иммунитета. Материал ориентирован на вопросы профессиональной компетенции будущих специалистов.

Ответственный за выпуск:

Кудаев Р.Х., проректор КБГАУ по УВР, профессор

© ФГБОУ ВО "Кабардино-Балкарский ГАУ", 2017

2

ТЕМА 1. ОРИЕНТИРОВОЧНАЯ И РАЗВЁРНУТАЯ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ

(ОРА И РА)

Цель: техника постановки ориентировочной реакции агглютинации (ОРА)

Задачи, подлежащие исследованию. Реакцию ставят для идентификации выделенной чистой культуры микроорганизмов на стекле. К капле взвеси исследуемой культуры бактерий добавляют каплю коммерческой агглютинирующей гипериммунной сыворотки. Стекло покачивают круговыми движениями в течение 1-2 минут. Результат реакции оценивается в четырѐх крестовой системе по степени агглютинации:

«++++» - в виде большого количества крупных хлопьев и полного просветления жидкости;

«-» - осадка нет, жидкость мутная.

Результат реакции на «++++» и «+++» считают положительным.

Техника постановки развѐрнутой (пробирочной) реакции агглютинации (РА)

Реакцию используют для выявления количества антител в сыворотке крови больного животного.

В ряду используют обычно пять пробирок:

-в 1-й находится 2.4 мл физиологического раствора

-в 3-й, 4-й и 5-й по 0.5 мл физиологического раствора.

В 1-ю пробирку добавляют 0.1 мл сыворотки для получения еѐ исходного разведения 1:25. Остальные пробирки используют для получения последовательных двух кратных разведений сыворотки в титрах с 1:25 до 1:200.

Во 2-5-ю пробирки с 0.5 мл разведѐнной сыворотки добавляют по 0.5 мл корпускулярного антигена в концентрации 109 м.к./мл. Общий объѐм содержимого 2-5-

йпробирок составляет 1 мл с разведениями сыворотки 1:50, 1:100, 1:200, 1:400. Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и инкубируют при 37◦С в

течение 20 часов.

Параллельно ставят "+" и "-" контроли.

Учѐт результатов начинают с контрольных пробирок. Результат реакции оценивается в четырѐх крестовой системе по степени агглютинации:

«++++» - хорошо выраженный осадок и полное просветление жидкости; «-» - осадка нет, жидкость мутная.

Результат реакции на «++++» и «+++» считают положительным. Максимальное разведение исследуемой сыворотки крови с положительным результатом называют титром сыворотки в РА.

Принцип метода. Склеивание корпускулярного антигена антителами диагностической гипериммунной агглютинирующей сыворотки.

Ход анализа.

1. Каждому студенту провести ОРА с одной диагностической гипериммунной агглютинирующей сывороткой для определения выданной на группу студентов культуры бактерий.

4

2.Результаты ОРА зафиксировать в тетради.

3.Сопоставив результаты всех студентов группы сделать заключение по идентификации культуры бактерий.

Оборудование и биологические объекты

1.Взвесь убитой культуры бактерий.

2.Диагностические гипериммунные агглютинирующие сыворотки.

3.Стѐкла для ОРА.

4.Дозаторы объѐмом 0,1-1 мл.

ЛИТЕРАТУРА

1. Кисленко, В. Н. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии [Текст]: Учеб. пособие / Кисленко, В. Н. – М.: КолосС, 2005. – 232 с.

5

ТЕМА 2. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ОРА ПРИ ДИАГНОСТИКЕ САЛЬМОНЕЛЛЁЗА ЖИВОТНЫХ

Цель: техника постановки ОРА с набором комплексных и моновалентных сальмонеллѐзных сывороток

На первом этапе ставится ОРА с групповыми О-сыворотками, которые объединены в 8 комплексов и обозначаются цифрами. По двум положительно среагировавшим комплексам определяют групповую О-сыворотку, имеющую сродство к данному микроорганизму. Групповая О-сыворотка указывает в инструкции на серогруппу, которая обозначается прописной буквой латинского алфавита.

На втором этапе ОРА ставят моновалентными сальмонеллѐзными Н-сыворотками. Сначала с Н-сыворотками 1-й фазы, а затем, если это необходимо, 2-й фазы, указанными в инструкции. Н-сыворотки позволяют определить серовариант сальмонелл внутри серогруппы.

Принцип метода. Склеивание корпускулярного антигена антителами диагностической гипериммунной агглютинирующей сыворотки.

Ход анализа.

1.Каждому студенту провести ОРА с одной комплексной сальмонеллѐзной диагностической гипериммунной агглютинирующей сывороткой для определения серогруппы выданной на группу студентов культуры сальмонелл.

2.Результаты ОРА зафиксировать в тетради.

3.Сопоставив результаты всех студентов группы сделать заключение по серогрупповой принадлежности сальмонеллы.

4.Каждому студенту провести ОРА с одной моновалентной сальмонеллѐзной Н-сывороткой (из указанных в инструкции для данной серогруппы) для определения сероварианта выданной на группу студентов культуры сальмонелл.

Оборудование и биологические объекты

1.Взвесь убитой культуры сальмонелл.

2.Набор диагностических гипериммунных агглютинирующих сальмонеллѐзных сывороток с инструкцией.

3.Стѐкла для ОРА.

4.Дозаторы объѐмом 0,1-1 мл.

ЛИТЕРАТУРА

1. Кисленко, В. Н. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии [Текст]: Учеб. пособие / Кисленко, В. Н. – М.: КолосС, 2005. – 232 с.

6

ТЕМА 3. РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РНГА)

Цель: техника постановки РНГА с эритроцитарным антигенным диагностикум

Реакцию ставят в пластиковых плашках.

Исследуемую сыворотку разводят до исходного разведения 1:50. В ряд из 12-и лунок вносят по 0.4 мл физиологического раствора. Затем в 1-ю лунку вносят 0.4 мл исходного разведения сыворотки и титруют еѐ в последующих лунках ряда, перенося из лунки в лунку по 0.4 мл содержимого. Из последней лунки 0.4 мл содержимого удаляют. Таким образом, общий объѐм содержимого лунок составляет 0.4 мл с разведениями сыворотки: 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600, 1:3200, 1:6400, 1:12800, 1:25600, 1:51200, 1:102400, 1:204800. В каждую лунку ряда вносят по 0.05 мл 2.5%-й

взвеси эритроцитарного антигенного диагностикума.

Содержимое лунок перемешивают встряхиванием плашки и инкубируют при 37◦С в течение 2.5 часов.

Параллельно ставят "+" и "-" контроли.

Учѐт результатов начинают с контрольных рядов лунок. Результат реакции оценивается в четырѐх крестовой системе:

«++++» - эритроциты на дне лунки в виде «перевѐрнутого зонтика»; «-» - эритроциты на дне лунки в виде «пуговки».

Результат реакции на «++++» и «+++» считают положительным. Максимальное разведение исследуемой сыворотки крови с положительным результатом называют титром сыворотки в РНГА.

Принцип метода. Склеивание эритроцитарного антигенного диагностика антителами сыворотки больного животного.

Ход анализа.

1.Каждому студенту провести РНГА с одной из предложенных сывороток животных.

2.Результаты РНГА зафиксировать в тетради.

Оборудование и биологические объекты

1.Исследуемые сыворотки животных.

2.Эритроцитарный антигенный диагностикум.

3.Физиологический раствор.

4.Пластиковых плашки.

5.Дозаторы объѐмом 0,1-1 мл.

6.Стеклянные градуированные пипетки на 1 мл.

7.Резиновые груши.

8.Штативы для пробирок.

9.Стѐкла для накрывания плашек.

ЛИТЕРАТУРА

1. Кисленко, В. Н. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии [Текст]: Учеб. пособие / В. Н. Кисленко. – М.: КолосС, 2005. – 232 с.

7

ТЕМА 4. РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РСК)

4.1ПРИНЦИП РЕАКЦИИ. ТИТРАЦИЯ ГЕМОЛИЗИНА И КОМПЛЕМЕНТА Цель: техника постановки РСК

Вреакции участвуют две системы: 1) бактериолитическая; 2) гемолитическая.

Вбактериолитическую систему входят антиген, исследуемая сыворотка крови, в гемолитическую – гемолизин и эритроциты барана. Комплемент может входить в любую систему.

Принцип реакции следующий. Если произошло образование комплекса «антигенантитело», то комплемент связывается с ним. Если комплекса «антиген-антитело» нет, то свободный комплемент способствует разрушению (гемолизу) эритроцитов гемолизином.

Для постановки РСК необходим ряд компонентов.

1. Коммерческий антиген в разведении, указанном на флаконе.

2. Исследуемая сыворотка крови, разведѐнная 1:10 и инактивированная нагреванием. 3. Гемолизин в рабочем титре.

4. Комплемент сыворотки крови морской свинки в соответствующем титре.

5.Взвесь отмытых эритроцитов барана в разведении 1:40 на физиологическом растворе.

6.Физиологический раствор.

Титрация гемолизина

В верхнем ряду пробирок готовится ряд последовательных пятисот кратных разведения гемолизина (табл. 1).

8

Нижний ряд пробирок инкубируют при 37◦С 15 минут. Учѐт начинают с первой пробирки. За предельный титр гемолизина принимаем наибольшее разведение его с полным гемолизом. За рабочий титр гемолизина принимают уменьшенный вдвое предельный титр.

Параллельно ставят отрицательные контроли комплемента и гемолизина.

Ряд пробирок инкубируют при 37◦С 15 минут. Учѐт начинают с последней пробирки. Титром комплемента считают наименьшее его количество, обеспечивающее полный гемолиз.

Параллельно ставят отрицательные контроли комплемента и гемолизина.

9

Принцип метода. Разрушение эритроцитов барана при совместном действии комплемента и гемолизина.

Ход анализа.

1.Студентам разделится на две группы.

2.1-й группе провести титрацию гемолизина.

3.2-й группе провести титрацию гемолизина.

4.Результаты титрации зафиксировать в тетради.

Оборудование и биологические объекты

1.Гемолизин.

2.Комплемент сыворотки крови.

3.Физиологический раствор.

4.Взвесь отмытых эритроцитов барана в разведении 1:40 на физиологическом растворе.

5.Стеклянная посуда

6.Дозаторы объѐмом 0,1-1 и 0,01-0,1мл.

7.Водяная баня

8.Штативы для пробирок.

4.2 ГЛАВНЫЙ ОПЫТ РСК

Цель: исследование сыворотки больного животного, которое осуществляется в два этапа:

1.Готовят в первом ряду пробирок последовательные двух кратные разведения исследуемой сыворотки от 1:20 до 1:320. В втором ряду пробирок смешивают по 0.5 мл

разведений исследуемой сыворотки крови с антигеном и комплементом. Инкубируют при 37◦С 20 минут (табл. 4).

2.К исследуемой смеси добавляют гемолизин и эритроциты барана и вновь инкубируют при 37◦С 15 минут (табл. 4).

Параллельно ставят отрицательный и положительный контроли антигена, а также отрицательный контроль исследуемой сыворотки.

Предварительный учѐт реакции проводят сразу после инкубации, а окончательный через 18 часов после выдерживания при комнатной температуре.

Сначала учитывают контрольные пробирки.

Учѐт в ряду начинают с первой пробирки. Результат реакции оценивается в четырѐх крестовой системе:

«++++» - отсутствие гемолиза: через 15 минут жидкость красная сильно мутная; через 18 часов жидкость бесцветная прозрачная, на дне пробирки осадок эритроцитов;

«-» - полный гемолиз: через 15 минут жидкость красная прозрачная; через 18 часов жидкость красная прозрачная, на дне пробирки осадка эритроцитов нет;

Результат реакции на «++++» и «+++» считают положительным. Максимальное разведение исследуемой сыворотки крови с положительным результатом называют титром сыворотки в РСК.

10