Москвина А.С.. Физиолого-биохимический статус крови крупного рогатого скота с возрастом в процессе поствакцинального иммуногенеза

На правах рукописи

Москвина Анна Сергеевна

ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЙ СТАТУС КРОВИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА С ВОЗРАСТОМ В ПРОЦЕССЕ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНОГЕНЕЗА

03.03.01– физиология

03.01.04– биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва 2013

1.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Физиолого-биохимический статус крови у млекопитающих на разных этапах индивидуального развития является совокупностью возрастных морфологических, биохимических и физиологических изменений, протекающих в организме на протяжении всей жизни (К.Б. Свечин с соавт., 1967; В.Н. Никитин, 1967; В.Ф.Лысов, 1977, 1982, 1996; Ю.Н. Шамберев, 1985; Л.П. Тельцов, 1997, 2003; В.И. Максимов, 1999, 2008; В.А. Гудин, 2005; В.С. Григорьев, 2006 и др.). Каждый период онтогенеза

ифизиологическое состояние организма крупного рогатого скота (беременность, лактация и т.д.) имеет свои отличительные особенности, связанные с наследственностью и факторами внешней среды, которые определяют характер обмена веществ, формирование морфологических систем организма, функций отдельных клеток, тканей и органов. В настоящее время в отечественной и зарубежной литературе имеется большое число работ, посвященных исследованию морфофизиологических и физиолого-био- химических показателей крови крупного рогатого скота в зависимости от различных внешних и внутренних факторов (Т.Т. Тарчоков, 1993; С.Г. Лумбунов, 1998; А.В. Бакай, 2006; Ю.А. Александров, 2010; Л.Г. Дыдаева, В.И.

Максимов, 2010; В.В Пайтерова, 2011; A.L. Jensen et al., 1992; L. Leskova et al., 2009 и др.). Однако, несмотря на многочисленные попытки установить определенные закономерности в изменениях показателей крови в зависимости от возраста, беременности и лактации, сезона, до сих пор у исследователей нет единого мнения о наличии определенных взаимосвязей между показателями и указанными факторами. Кроме того, ощущается недостаток точных научных данных по возрастной динамике морфофизиологических и физиологобиохимических показателей крови у телят, между тем именно эти данные служат одной из основ при организации профилактических и лечебных мероприятий.

Известно, что введение животным биологических препаратов воздействует на морфофизиологический и физиолого-биохимический состав крови, причем, чем более токсичен и биологически активен препарат, тем существеннее эти изменения (П.А. Красочко с соавт., 2007). Вакцинация уже стала неотъемлемой частью современного способа ведения животноводства и, будучи мощным стресс-фактором, может оказывать значительное влияние на системы организма, в том числе и на систему крови, изменяя ее морфофизиологические

ифизиолого-биохимические показатели. Вопросы, касающиеся формирования поствакцинального иммунного ответа на различные типы вакцин изучены достаточно широко, однако воздействие вакцинации как таковой и влияние той

3

или иной вакцины на морфофизиологический и физиолого-биохимический состав крови коров на позднем сроке стельности и телят, в процессе раннего онтогенеза, приобретает особую актуальность и требует детального изучения. Это обусловлено, прежде всего, требованиями к качеству всех типов применяемых в животноводстве вакцин, основными из которых является безвредность, экологическая и биологическая безопасность (В.А. Сергеев с соавт., 2007, Е.В. Шемельков, О.А. Верховский, 2009).

Целью работы является оценка физиолого-биохимического статуса крови крупного рогатого скота (коров на поздних сроках гестации и их потомства) в зависимости от физиологического состояния и возраста, и в процессе поствакцинального иммуногенеза.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1)определить морфофизиологический и физиолого-биохимический статус крови коров на последнем триместре беременности при функциональной нагрузке в виде иммунизации коммерческой инактивированной комбинированной вакциной против инфекционного ринотрахеита, парагриппа- 3, вирусной диареи, респираторно-синцитиальной, рота-, коронавирусной болезней крупного рогатого скота («Комбовак») и экспериментальной инактивированной вакциной против вышеуказанных болезней, приготовленной на основе масляного адъюванта Montanide ISA 70;

2)изучить динамику формирования противовирусного иммунного ответа у коров на поздних сроках стельности, иммунизированных инактивированными противовирусными вакцинами;

3)определить закономерности становления морфофизиологических и физиолого-биохимических показателей крови у телят, полученных от иммунных коров-матерей и вакцинированных в дальнейшем аналогичными противовирусными препаратами, в различные периоды постнатального онтогенеза, начиная с фазы новорожденности;

4)определить закономерности становления морфофизиологических и физиолого-биохимических показателей крови у телят, полученных от неиммунных коров-матерей в процессе постнатального онтогенеза;

5)изучить динамику формирования противовирусного гуморального иммунного ответа у телят после применения вакцин;

6)провести сравнительную оценку безвредности и антигенной активности используемых вакцин на стельных коровах и их потомстве.

Научная новизна. Дана характеристика морфофизиологического и фи- зиолого-биохимического статуса крови коров на последнем триместре беременности (225 – 267 сут.) при функциональной нагрузке в виде вакцинации инактивированными противовирусными препаратами.

4

Впервые проведены исследования морфофизиологических показателей крови телят согласно современной периодизации развития крупного рогатого скота в постнатальный период с учетом фактора вакцинации и последующего формирования специфического противовирусного иммунного ответа. Определены закономерности становления физиолого-биохимических показателей крови у телят, полученных от вакцинированных коров-матерей, в процессе онтогенеза, начиная с фазы новорожденности.

Установлено, что динамика изменения и значительное увеличение количества лейкоцитов у телят черно-пестрой породы в фазе новорожденности совпадают с возрастной динамикой изменения количества данных форменных элементов крови у новорожденных животных других видов и человека.

Впервые проведен корреляционный анализ взаимосвязей между морфофизиологическими, физиолого-биохимическими и серологическими показателями стельных коров и телят на различных этапах онто- и иммуногенеза.

Практическая значимость. Результаты работы позволяют использовать морфофизиологические и физиолого-биохимические показатели крови стельных коров (225 – 267 сут. гестации) и телят в качестве интервалов референтных величин при проведении исследований, связанных с их количественными изменениями в процессе онто- и иммуногенеза.

Установлено, что применение вакцины «Комбовак» и экспериментальной противовирусной вакцины вызывает незначительные (в интервалах референтных величин) изменения морфофизиологических и физиологобиохимических показателей крови животных и не оказывает существенного влияния на становление гемопоэза у телят в период раннего онтогенеза. Это свидетельствует о безвредности испытуемых препаратов и как следствие пищевой безопасности продуктов, полученных от вакцинированных животных.

Впервые дана сравнительная оценка влияния нового (Montanide ISA 70) адъюванта, включенного в состав экспериментальной вакцины, предназначенной для специфической профилактики шести основных вирусных болезней крупного рогатого скота, на формирование поствакцинального иммунного ответа у естественно-восприимчивых животных.

Апробация работы. Результаты исследований доложены и обсуждены на: Международной научно-практической конференции, посвященной 90-летию со дня основания кафедры физиологии животных ФГОУ ВПО МГАВМиБ, 2010г. (г. Москва, ФГОУ ВПО МГАВМиБ); Международной научной конференции «Лекарственные препараты для животных», 2011г (г. Москва, ФГУ ВГНКИ); VII съезде Казахского физиологического общества: «Современная физиология: от клеточно-молекулярной до интегративной – основа здоровья и долголетия», 2011г. (г. Алматы, КазНАУ); ІІІ съезде физиологов СНГ, 2011г. (г. Ялта, Ук-

5

раина); общеакадемических научно-методических советах ФГБОУ ВПО МГАВМиБ (Москва, 2009, 2010 гг.); межкафедральном совещании по предварительной экспертизе диссертации в ФГБОУ ВПО МГАВМиБ (Москва, 2012 г.); Международной научной конференции «Научное и кадровое обеспечение инновационного развития агропромышленного комплекса», 2013. (г. Казань, ФГБОУ ВПО КГАВМ).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

-составленные референтные величины морфофизиологических и фи- зиолого-биохимических показателей крови вакцинированных коров на последнем триместре беременности;

-динамика изменения значений морфофизиологических и физиологобиохимических показателей крови телят в различные периоды постнатального онтогенеза и поствакцинального иммуногенеза;

-динамика формирования противовирусного гуморального иммунного ответа у стельных коров (225 – 267 сут. беременности) и телят в процессе поствакцинального иммуногенеза.

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, в т.ч. 5 статей в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК при Минобрнауки РФ, 4 – в материалах Международных и Российских конференций, 1 – промежуточный отчет в ФГНУ «Центр информационных технологий и систем органов исполнительной власти».

Личный вклад соискателя. Все экспериментальные и теоретические исследования по теме диссертации проведены лично соискателем.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 126 стр.

машинописного текста и состоит из общей характеристики работы, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, практических предложений и списка литературы. Материалы диссертации иллюстрированы 8 таблицами и 19 рисунками. Список литературы включает 242 источника (220 отечественных и 22 зарубежных авторов).

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в 2008 – 2012 гг. на базе кафедры физиологии животных им. А.Н Голикова ФГБОУ ВПО МГАВМиБ, лаборатории иммунологии и биохимии АНО «НИИ ДПБ», в хозяйстве ОАО «Агрофирма – Рогачево» Дмитровского района Московской области.

6

Экспериментальные животные. Опыты проводили на физиологически здоровых стельных коровах черно-пестрой породы и полученном от них потомстве. Нормы кормления и содержания животных соответствовали утвержденным рекомендациям (А.П. Калашников с соавт., 2003). Для проведения экспериментов коровы были разделены на три группы по принципу аналогов (порода, живая масса, возраст, срок стельности). Животные двух опытных групп (первая и вторая) были подвергнуты двукратной вакцинации, животные контрольной (третья) группы оставались интактными. Телят, полученных от коров-матерей опытных групп, вакцинировали аналогичными препаратами, телята, рожденные от коров контрольной группы, оставались неиммунными.

Вакцины. Для вакцинации животных первой опытной группы (n=8) использовали коммерческую инактивированную комбинированную вакцину против инфекционного ринотрахеита (ИРТ), парагриппа-3 (ПГ-3), вирусной диареи (ВД), респираторно-синцитиальной (РСИ), рота- (РВ), коронавирусной (КВ) болезней крупного рогатого скота на производственном адъюванте – гидроокись алюминия и сапонин («Комбовак», производитель ООО «Ветбиохим», г. Москва; серия №4, изготовлена: 08.2009, годна до 02.2011). Животных второй опытной группы (n=8) вакцинировали экспериментальной комбинированной инактивированной вакциной, изготовленной с эквивалентным содержанием вирусных антигенов на основе коммерческого масляного адъюванта - Montanide ISA 70 (SEPPIC, Франция). Экспериментальная вакцина (экспериментальная серия №6, изготовлена: 09.2009, годна до 09.2010) была приготовлена и любезно предоставлена канд.вет.наук Е.В. Шемельковым.

Схема опыта. Вакцины вводились опытным коровам в дозе 3 см3 двукратно на 225-е и 246- е сут. стельности. Телят, полученных от иммунных коров-мате- рей опытных групп (n=8 в каждой), вакцинировали аналогичными препаратами двукратно в дозе 2 см3 на 75- е и 96- е сут. после рождения.

Для контроля здоровья опытных и контрольных коров и их потомства проводили клинический осмотр (ежедневный у телят в фазу новорожденности и периодически в течение последующих исследований), который включал в себя

– определение наличия аппетита, проявление рефлексов, характеризующих активность центральной нервной системы, частоты сердечных сокращений и дыхательных движений, температуры тела.

Определение морфофизиологического и физиолого-биохимического статуса крови коров проводили: 1) на 225 сут. стельности (период до вакцинации для опытных групп); 2) на 246 сут. (через 21 сутки после первой вакцинации - период формирования первичного иммунного ответа для опытных групп); 3) на 267 сут. стельности (через 21 сутки после повторной вакцинации - период формирования вторичного иммунного ответа для опытных групп).

7

Морфофизиологические и физиолого-биохимические показатели крови телят исследовали в динамике, согласно современной периодизации развития крупного рогатого скота в постнатальный период с учетом фактора вакцинации и последующего формирования специфического иммунного ответа (В.Ф. Лысов, 1977; Л.П.Тельцов, 1996, 2008): 1) в период колострального иммунитета (3-е сутки жизни); 2) в конце фазы новорожденности (10-е сутки жизни); 3) в молочную фазу (30-е сутки жизни); 4) в переходную фазу (75-е сутки после рождения, это же время до вакцинации для опытных групп); 5) 96-е сутки жизни (для опытных групп — период формирования первичного иммунного ответа); 6) 117-е сутки жизни (для опытных групп — период формирования вторичного иммунного ответа); 7) в растительную фазу (235-е сутки после рождения).

Испытуемые пробы. В качестве испытуемых проб использовали кровь и сыворотку крови, полученную индивидуально от каждого животного в соответствующую возрастную фазу.

Морфофизиологические и физиолого-биохимические методы. В

стабилизированных образцах крови определяли количество эритроцитов (RBC), лейкоцитов (WBC), тромбоцитов (PLT), концентрацию гемоглобина (HGB) и гематокрит (HCT), с использованием автоматического гематологического ветеринарного анализатора PCE-90Vet (ERMA, Япония). Физиологобиохимические исследования сыворотки крови проводили на биохимическом анализаторе Hitachi 902 Roche Diagnostic (Roche, Швейцария) с использованием стандартизированных методик, согласно рекомендациям IFCC. В испытуемых пробах определяли уровень общего белка унифицированным методом по биуретовой реакции, ферментативную активность аспартатаминотрасферазы (АсАТ) – кинетическим - УФ-методом, аланинаминотранферазы (АлАТ) - кинетическим методом, щелочной фосфатазы (ЩФ) - оптимизированным кинетическим методом и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) - кинетическим - УФметодом.

Реакция нейтрализации (РН). РН ставили микрометодом в 96-луночных полистироловых планшетах по стандартной методике с постоянной дозой соответствующего вируса (1000 ТЦД50/см3). Вируснейтрализующий титр сыворотки выражали как предельное ее разведение, ингибирующие развитие ЦПД вируса в 50% зараженных культур клеток. В качестве референтных использовали моноспецифические антисыворотки к вирусам ИРТ, ПГ-3, ВД, РСИ, рота- и коронавирусам крупного рогатого скота, полученные из Центральной ветеринарной лаборатории, Вейбридж, Великобритания.

Иммуноферментный метод (ИФА). В работе были использованы коммерческие ИФА-наборы: «Набор для выявления антител к вирусу инфек-

8

ционного ринотрахеита крупного рогатого скота иммуноферментным методом «ИРТ-Серотест» (ООО «Ветбиохим»), «Набор для выявления антител к респираторно-синцитиальному вирусу крупного рогатого скота иммуноферментным методом «РСИ-Серотест» (ООО «Ветбиохим») и «Набор для выявления антител к вирусу ВД крупного рогатого скота» (Svanova, Швеция). Постановку реакции, учет и интерпретацию полученных результатов проводили согласно наставлению по применению, рекомендованному фирмой-произво- дителем.

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами с использованием программ

Microsoft Office Excel 2007, Stat Plus 2005.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Результаты клинического осмотра животных опытных и контрольных групп свидетельствуют о том, что они оставались физиологически здоровыми в течение всего периода исследования.

3.1. Морфофизиологические показатели крови коров на поздних сроках стельности

Анализ полученных результатов, приведенных в табл.1, свидетельствует о статистически значимом изменении количества лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов на поздних сроках гестации.

Так у коров контрольной, первой и второй опытных групп количество лейкоцитов на 42-е сут. опыта снизилось на 53,8% (P<0,05), 52,3% (P<0,05) и 68% (P<0,01) соответственно. По сравнению с контролем данный показатель в первой опытной группе был выше на 19,9% (P<0,05), а во второй – ниже на 6,9% (P<0,05). На 267-е сут количество эритроцитов у стельных коров всех групп повысилось: на 9,8% (контроль), 11,7% (P<0,05) и 10,3%(P<0,05) (первая и вторая опытные группы соответственно) по сравнению с данными, полученными на 225-е сут. стельности. На 267-е сутки стельности количество тромбоцитов в крови коров контрольной, первой и второй опытных групп снизилось на 26,5%, 43,7% (P<0,01) и 53% (P<0,001) соответственно по сравнению с данными в начале опыта, что может быть связано с повышенным потреблением данных форменных элементов крови в периферическом кровообращении по мере приближения к отелу, т.к. им принадлежит важная роль в поддержании естественной резистентности и функции микрососудов. При этом в опытных группах снижение количества тромбоцитов было более значимым, что, по нашему мнению, может быть связано с их транспортной функцией, в т.ч. и

9

переносом вирусспецифических IgG - антител, синтезирующихся в организме в ответ на вакцинацию.

Таблица 1. Морфофизиологические показатели крови коров на поздних сроках стельности (M±m)

Примечание: 1…3 – статистически значимые различия внутри группы; #- статистически значимые различия между опытной и контрольной группой (P 0,05).

Концентрация гемоглобина и уровень гематокрита в крови у стельных коров не претерпевали статистически значимых изменений во всех экспериментальных группах в течение всего периода наблюдения.

3.2. Физиолого-биохимические показатели сыворотки крови коров на поздних сроках стельности

Результаты определения физиолого-биохимического статуса крови у интактных и иммунных коров на поздней стадии стельности свидетельствуют о наличии статистически значимых изменениях показателей концентрации белка, активности трансаминаз, ЩФ и ЛДГ (табл. 2). При этом динамика изменений была идентичной у животных опытных и контрольной групп.

По мере приближения к отелу (267-е сут. стельности) концентрация белка в сыворотке крови животных контрольной, первой и второй опытных групп снизилась на 18,5% (P<0,001), 18,2% (P<0,05) и 13% (P<0,001) соответственно.

Параллельно со снижением концентрации общего белка, в крови происходило снижение активности трансаминаз. Так активность АлАТ у коров опытных и контрольной групп снизилась в среднем на 22-24% (P<0,05) на 246-е сутки и на 32–35% (P<0,01) на 267-е сутки беременности. Этот процесс является следствием аминокислотного дефицита, наблюдаемого в конце беременности, и соответствует физиологической целесообразности, обеспечивая минимальное использование субстратов организмом матери при максимальном использовании в фетоплацентарном комплексе.

10