3.6. Определение капсаициноидов и ионола в перцовых пластырях методом вэжх

Нередко наряду с фенолами из твёрдой матрицы могут экстрагироваться гидрофобные или гидрофильные компоненты, находящиеся в матрицах в несвязанном виде. В этом случае возникает задача удаления мешающих примесей из анализируемой пробы. Одним из таких случаев является проблема хроматографического определения капсаициноидов и ионола в обезболивающих перцовых пластырях, в состав которых в качестве основных активных компонентов наряду с капсаициноидами вводят большое количество анальгина. Для стабилизации каучуковой основы пластырей в него добавляют антиоксидантную присадку – ионол. Кроме этого, перцовые пластыри содержат заметное количество каротиноидов, также мешающих определению.

Капсаицин, как и ионол, являются гидрофобными орто-замещёнными производными фенола (критерий гидрофобности КП lоgP =3,66, а ионола lоgP =5,54). Эти вещества практически не растворимы в воде, но умеренно растворимы в спиртах.

Содержание анальгина в пластыре в 40 раз превышает суммарное количество капсаициноидов. Методики ВЭЖХ контроля капсаициноидов разработанные и аттестованные для его анализа в пластыре [93], не содержащем анальгин, оказались малопригодны для новой лекарственной формы с его добавкой, так как широкий хроматографический пик анальгина уменьшает надежность определения капсаициноидов. В связи с этим актуальной стала задача модификации пробоподготовки с разделением этих компонентов.

Анальгин является полярным гетероциклическим соединением, он хорошо растворим в воде и слабо растворим в спиртах [49]. В качестве экстрагентов испытаны системы ацетонитрил, ИПС, ацетон, этанол и их смеси с водой в присутствии различных высаливателей (Li₂SO₄, или (NH₄)₂SO₄). Найдено, что извлекаемые вещества – капсаициноиды и ионол – наиболее полно экстрагируются ИПС при однократной экстракции (степени извлечении 95 и 98 % соответственно), а анальгин не переходит в органическую фазу (степень извлечения ~0 %), то есть происходит разделение этих компонентов на стадии экстракции. Экстракт на основе ИПС в присутствии (NH₄)₂SO₄ содержит небольшое (~2 об. %) количество воды, которая незначительно разбавляет ИПС, при этом наличие воды повышает его экстракционную способность.

В известной методике анализа капсаициноидов в пластыре [94] для пробоподготовки точную навеску пластыря произвольно разрезают на полоски, освобождают полоски от защитного покрытия, помещают в круглодонную колбу, заливают водным раствором этанола 54 % и кипятят на водяной бане с обратным холодильником в течение 15 мин. После охлаждения вытяжку количественно переносят в мерную колбу, извлечение капсаициноидов повторяют ещё раз. Полученный водно-этанольный раствор после фильтрации используют для анализа методом ВЭЖХ. В качестве ПФ применяют этанольный 54% раствор, в качестве НФ – Сепарон С18 или аналогичный сорбент.

Недостатками этой методики являются высокая растворимость анальгина в водно-спиртовом экстрагенте, в результате чего его присутствие на хроматограмме затрудняет определение капсаициноидов, высокая вязкость, близкая к эквиобъёмному составу ПФ этанол – вода, что приводит к уменьшению надежности работы микроколоночного хроматографа и дополнительному уширению хроматографических пиков.

Эксперимент показал, что ЭС на основе ИПС и (NH₄)₂SO₄ может быть успешно использована для решения данной аналитической задачи. ГСО капсаицина представляет собой смесь этого вещества с дигидроксикапсаицином с установленным количественным соотношением. На рис. 3.24 приведена хроматограмма стандарстного образца капсаицина, выделенного из красного стручкового перца.

Рис. 3.24. Хроматограмма раствора стандартного образца капсаицина (ВФС 42-1753-87).

Ниже приведена блок-схема усовершенствованной методики контроля капсаициноидов и ионола с учётом требований разрабатываемой вновь фармакопейной статьи на новую лекарственную форму перцового пластыря с обезболивающим эффектом (рис. 3.25).

Рис. 3.25. Блок-схема усовершенствованной методики контроля капсаициноидов и ионола

Методика была испытана на реальных образцах перцовых пластырей, содержащих и не содержащих анальгин, и пластырей, не содержащих перцовых экстрактов. На рис. 3.26 и 3.27 приведены для примера две хроматограммы анализа по рассматриваемой методике.

Рис. 3.26. Хроматограмма экстракта из перцового пластыря,

полученная с применением изократического режима ОФ ВЭЖХ,

сорбент Диасорб 130 С16Т, ПФ ацетонитрил – вода (1:1), расход 70 мкл/мин, 274 нм: 1, 2 – пики капсаициноидов

Рис. 3.27. Хроматограмма экстракта из перцового пластыря, полученная с применением изократического режима ОФ ВЭЖХ, сорбент Диасорб 130 С16Т, ПФ ацетонитрил – вода (4:1), расход 120 мкл/мин, 274 нм: 1 – пик ионола

Как видно из этих хроматограмм, оптимизированные условия анализа капсаициноидов и ионола различаются, общей остается протокол пробоподготовки.

Достоверность полученных результатов данной методикой проверяли методом «введено-найдено» (табл. 3.17). Полученные результаты надежны (t_расч<t_табл) и воспроизводимы; систематическая погрешность среднего результата незначима, поэтому можно считать, что доверительная граница суммарной погрешности равна доверительной границе случайной погрешности.

Таблица 3.17

Результаты определения ионола, капсаициноидов и анальгина

экстракционно-хроматографическим способом ; п=5, Р=0,95, F_табл=6,4, F_эксп=5,2

Введено, мг/л			Найдено, мг/л
ионол	капсаициноиды	анальгин	ионол	Sr	капсаициноды	Sr	анальгин
4,0	1,0	2,0	3,9±0,1	0,099	0,9±0,1	0,099	_
0,40	0,1	0,2	0,40±0,02	0,019	0,09±0,01	0,01	_
0,04	0,01	0,02	0,04±0,001	0,001	0,01±0,002	0,002	_

Хроматографическое определение капсаициноидов и ионола с экстракционным разделением аналитов характеризуется селективностью, низкими пределами обнаружения, правильностью и воспроизводимостью получаемых результатов. продолжительность анализа вместе с пробоподготовкой ~ 60 мин. Определение капсаициноидов и ионола проводили с пробами новый пластыря, использованного по назначению и пластыря с просроченным сроком годности (табл. 3.18).

Таблица 3.18

Результаты испытания способа определения капсаициноидов и ионола

при анализе различных образцов пластырей; п=5, Р=0,95

Анализируемый пластырь	Найдено, мг/л
	капсаициноиды	ионол
Свежепроизведенный пластырь	0,11±0,02	0,36±0,02
Пластырь, использованный по назначению	-	0,14±0,01
Пластырь с просроченным сроком годности	0,10±0,03	0,36±0,03

Результаты анализа различных пластырей подтверждают, что основным лечебным свойством обладают капсаициноиды, и при использовании пластыря «по способу применения» капсаициноиды практически полностью расходуются , поэтому в таких пробах они не обнаружены. Ионол лишь частично расходуется, так как каучуковая основа пластыря нарушается при его применении. Проанализированы пробы пластыря с просроченным сроком годности, в результате анализа не было обнаружено изменений концентраций ионола и капсаициноидов в составе пластырей.

Рассмотренная усовершенствованная методика контроля капсаициноидов в перцовом пластыре с обезболивающим эффектом успешно апробирована в ОАО «Верофарм», г. Воронежа и может быть рекомендована для валидации и включения в изменённую фармстатью.