15. Динамика антителообразования. Скорость образования антител ( ат ). Первичный иммунный ответ. Вторичный иммунный ответ. Иммунологическая память

На скорость образования антител ( АТ ) влияет ряд факторов: доза Аг (сила Аг-воздействия), частота Аг-стимуляции и состояние иммунной системы индивида (то есть его иммунный статус). Если организм впервые встречается с Аг, то развивается первичный иммунный ответ, а при повторном контакте — вторичный ответ.

Первичный иммунный ответ.Появлению антител ( АТ ) предшествует латентный период продолжительностью 3~5 сут. В это время происходит распознавание Аг и образование клонов плазматических клеток. Затем наступает логарифмическая фаза, соответствующая поступлению антител ( АТ ) в кровь; её продолжительность — 7-15 сут. Постепенно титры антител ( АТ ) достигают пика и наступает стационарная фаза, продолжительностью 15-30 сут. Её сменяет фаза снижения титров AT, длящаяся 1-6 мес. В основу пролиферации клеток-продуцентов AT заложен принцип селекции. В динамике антителообразования титры высокоаффинных AT постепенно нарастают: после иммунизации аффинность AT к Аг постоянно увеличивается. Первоначально образуются IgM, но постепенно их образование уменьшается и начинает преобладать синтез IgG. Так как переключение синтезов от IgM к IgG не меняет идиотипа AT (то есть его специфичность по отношению к конкретному Аг), то оно не связано с клональной селекцией. Особенности первичного ответа — низкая скорость антителообразования и появление сравнительно невысоких титров AT.

Вторичный иммунный ответ. После антигенной стимуляции часть В- и Т-лимфоцитов циркулирует в виде клеток памяти. Особенности вторичного иммунного ответа — высокая скорость антителообразования, появление максимальных титров антител ( АТ ) и длительное (иногда многолетнее) их циркулирование. Основные характеристики вторичного имунного ответа:

• образование антител ( АТ ) индуцируется значительно меньшими дозами Аг;

• индуктивная фаза сокращается до 5-6 ч;

• среди антител ( АТ ) доминируют IgG с большой аффинностью, пик их образования наступает раньше (3-5 сут);

• Антитела ( АТ ) образуются в более высоких титрах и циркулируют в организме длительное время.

Иммунологическая память. При повторной встрече с антигеном организм формирует более активную и быструю иммунную реакцию — вторичный иммунный ответ. Этот феномен получил название иммунологической памяти.

Иммунологическая память имеет высокую специфичность к конкретному антигену, распространяется как на гуморальное, так и клеточное звено иммунитета и обусловлена В- и Т-лимфоцитами. Она образуется практически всегда и сохраняется годами и даже десятилетиями. Благодаря ей наш организм надежно защищен от повторных антигенных интервенций.

16. Реакции иммунитета: механизм, ингредиенты, практическое применение, способы постановки. Реакции нейтрализации токсина антитоксинами; реакция преципитации, РНГА, РСК.

Реакция гемолиза (РГ) – это разрушение эритроцитов при действии антител при участии комплемента.

Компоненты РГ.

1. Антиген - 3% взвесь эритроцитов на изотоническом растворе хлорида натрия;

2. Антитело - гемолитическая сыворотка – сыворотка, содержащая антитела к эритроцитам (гемолизины); сыворотку получают путем иммунизации кроликов эритроцитами барана;

3. Комплемент – система белков крови, которые адсорбируюся на комплексе антиген-антитело и формируют мембраноатакующий комплекс, который разрушает антиген, т.е. разрушает эритроциты или, по-другому, вызывает лизис эритроцитов (гемолиз). В качестве комплемента используется свежеприготовленная сыворотка крови морских свинок.

Если в пробирку поместить в определенных количествах эритроциты, гемолитическую сыворотку и комплемент, то в течение нескольких минут произойдет разрушение (гемолиз) эритроцитов, в результате чего смесь из темно-красной станет розовой ("лаковая кровь").

Реакция гемолиза используется в качестве индикатора при постановке реакции связывания комплемента.

P.S. Серологический метод. Серологические исследования основаны на физиологичеком феномене – образовании в организме, в сыворотке крови антител в ответ на попадание в организм чужеродного белка (антигена) – микроба, вируса, измененных тканей организма. Серологические исследования используются в практике при диагностике бактериальных, вирусных инфекциий, болезней, обусловленных нарушениями иммунной системы организма, в том числе инфекций, передаваемых половым путем.

Реакция связывания комплемента.

Реакция связывания комплемента (РСК) – это сложная серологическая реакция, в которой участвуют 2 системы антиген-антитело и комплемент. 1-ая система – специфическая, 2-ая – гемолитическая система.

Эта реакция разработана Ж.Борде и О.Жангу, которые установили, что при образовании комплекса антиген-антител с этим комплексом связывается комплемент. Видимого эффекта при этом не наблюдается, поэтому для выявления связывания комплемента (а следовательно, и для выявления образования комплекса антиген-антитело при их соответствии друг другу), т.е. в качестве индикатора используется 2-ая – гемолитическая система.

РСК используется чаще для серодиагностики (обнаружения антител к возбудителю заболевания в сыворотке крови больного) гонореи, сифилиса, коклюша, сыпного тифа и др. риккетсиозов и многих вирусных заболеваний. РСК также используется для сероидентификации.

Компоненты РСК.

1. Антиген – экстракты микробов, гаптены, реже – взвесь микробов, т.е. антиген может быть как корпускулярным (нерастворимым), так и молекулярным (растворимым).

2. Антитело – инактивированная щсыворотка крови больного человека (при серодиагностике) или иммунная диагностическая сыворотка, содержащая известные антитела (при сероидентификации).

3. Эритроциты барана – антигены гемолитической реакции.

4. Гемолитическая сыворотка – сыворотка, содержащая антитела к эритроцитам барана. Сыворотку получают путем иммунизации кролика эритроцитами барана.

5. Комплемент – свежеприготовленная сыворотка крови морских свинок (жидкая или лиофильно высушенная).

6. Электролит – изотонический раствор хлорида натрия.

Постановка РСК.

Перед постановкой опыта антиген, сыворотка больного, гемолитическая сыворотка и комплемент титруются (определяется их титр). Сыворотка больного прогревается при 56С в течение 30 мин.

РСК проводят в 2 фазы.

I фаза – специфическая: в одной пробирке готовят специфическую систему - смешивают равные количества известного антигена, сыворотки больного и комплемента, в другой пробирке готовят гемолитическую систему – смесь эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, пробирки ставят в термостат при 37С на 30 мин. Одновременно готовят контроли на антиген, комплемент и гемосистему, контрольные пробы с сывороткой заведомо больного человека (положительная сыворотка) и заведомо здорового человека (отрицательная сыворотка) и также помещают в термостат на 30 мин.

II фаза – индикаторная: в исходную смесь и во все контрольные пробирки добавляют одинаковые количества гемолитической системы и учитывают результаты реакции после выдерживания в термостате 30 мин.

Учет результатов РСК проводят при безупречных результатах в контролях.

Положительная реакция (человек болен и в его сыворотке имеются соответствующие антитела к возбудителю заболевания - антигену): в I фазе в специфической системе образуются комплексы антиген-антитело, с которыми связывается комплемент, после добавления гемолитической системы во II фазе гемолиз не наблюдается, так как комплемент связан 1-ой специфической системой. Видимый эффект – образование осадка эритроцитов.

Отрицательная реакция (человек здоров и в его сыворотке нет антител к возбудителю заболевания): комплексов антиген-антитело не образуется и комплемент в I фазе остается свободным, после добавления гемолитической системы во II фазе комплемент связывается с обязательно имеющимися здесь комплексами антиген-антитело (это комплексы эритроциты-антиэритроцитарные антитела) и вызывает гемолиз эритроцитов. Видимый эффект – гемолиз эритроцитов – "лаковая кровь".

В диагностике инфекционных заболеваний также используются реакция нейтрализация (РН) токсина антитоксической сывороткой, реакция иммунофлюоресценции (РИФ), радиоиммунный анализ (РИА), иммуноферментный анализ (ИФА).

Гемолитическая сыворотка

Гемолитическую сыворотку получают путем гипериммунизации животных взвесью эритроцитов барана. Титром гемолитической сыворотки называется то ее мак­симальное разведение, которое в объеме 0,5 мл в присутствии комплемента в рабочей дозе вызывает гемолиз 0,5 мл 3%-ной взвеси эритро­цитов барана в течение часа при температуре 37°С. Гемолитическая сыворотка применяется в реакции связы­вания комплемента (РСК.) в индикаторной системе (гемоли­тическая сыворотка+эритроциты барана). Используют в серологичской диагностике сифилиса, гонореи, микоплазменных, хламидийных инфекций, вирусных заболеваний и др.

Комплемент

Комплемент представляет собой свежую или консервированную сыворотку морской свин­ки. Комплемент применяется в реакции связывания комплемента (РСК) и в реакции бактериолиза.

Перед постановкой каждого опыта проводят титрование комплемента и определяют его рабочую дозу.

Титром компле­мента является то его наименьшее количество, которое вызы­вает гемолиз 3%-ной взвеси эритроцитов барана в присутствии гемолитической сыворотки (в тройном титре) в течение 30 ми­нут при 37°С В реакции связывания комплемента применяют рабочую дозу комплемента, увеличенную в сравнении с титром на 20-25%. Практически в качестве рабочей дозы бе­рется то количество комплемента, которое находится во второй пробирке, в которой произошел гемолиз.

К реакциям иммунитета относятся реакция агглютинации (РА), реакция преципитации (РП), реакция связывания комплемента (РСК).

Реакция агглютинации – это склеивание и выпадение в осадок микробных или других клеток (эритроцитов) под действием антител в присутствии электролита. Видимый эффект реакции (феномен агглютинации) – образование осадка, который называется агглютинатом.Эту реакцию используют для серодиагностики и сероидентификации. РА используют для серодиагностики (обнаружение антител в сыворотке крови больных) брюшного тифа и паратифа (реакция Видаля), бруцеллеза (реакция Райта), туляремии и лептоспироза. РА используют для сероидентификации (определения вида возбудителя, выделенного от больного) при кишечных инфекциях, коклюше, холере и др

Методы постановки реакции агглютинации:

1) развернутая реакция агглютинации ставится в пробирках с последовательными разведениями сыворотки;

2) реакция агглютинации на предметном стекле в капле сыворотки, разведенной 1:5 - 1:10; наступает в течение нескольких минут.

Для определения антигенной структуры микробов, выделенных из организма пациента, используют агглютинирующую сыворотку, полученную из крови животного (кролика, барана), иммунизированного этими микробами. Титром диагностической агглютинирующей сыворотки называется наибольшее ее разведение, которое вызывает агглютинацию. Если агглютинирующая сыворотка содержит антитела против Н-антигена, то подвижные бактерии склеиваются своими жгутиками, образуются рыхлые хлопья. Это крупнохлопчатая агглютинация, наступающая быстро - в течение двух часов.Сыворотка, содержащая О-агглютинины, вызывает мелкозернистую агглютинацию в течение 18- 24 часов. Агглютинирующие сыворотки, полученные путем иммунизации животных микробами, могут содержать антитела против родственных микробов, то есть являются поливалентными. Для повышения специфичности сывороток из них удаляют групповые антитела методом адсорбции по Кастелляни, с помощью групповых антигенов. Полученные сыворотки называют адсорбированными. Оставляя антитела только к одному антигену, получают монорецепторные сыворотки. С такими сыворотками ставят реакцию агглютинации на стекле, которая в этом случае является окончательной, а не ориентировочной. Для обнаружения антител в сыворотке крови пациента в качестве известного антигена используют убитые культуры микробов, так называемые диагностикумы.

При постановке серологического диагноза учитывают диагностический титр сыворотки - для большинства заболеваний 1:100 или 1:200.

Реакция агглютинации на стекле: необходимые ингредиенты, метод постановки; как выглядит положительная реакция; в чём преимущество реакции по сравнению с развёрнутой реакцией агглютинации и в чём её недостаток; в каком случае реакция агглютинации на стекле является ориентировочной, а в каком случае она даёт окончательный результат? Ориентировочная реакция агглютинации на стекле. К капле агглютинирующей сыворотки (разведение 1 : 20) добавляют взвесь бактерии, выделенных от больного животного. как выглядит положительная реакция; Реакцию считают положительной, если агглютинацию наблюдают в разведениях, близких к титру диагностической сыворотки. в чём преимущество реакции по сравнению с развёрнутой реакцией агглютинации и в чём её недостаток;

1)ориентировочная РА: - на предметном стекле; - наступающая в течение нескольких минут. - применяется только с целью идентификации вида (серотипа) выделенной из организма больного чистой культуры по его специфичности как АГ к серотипу АТ;

2) развернутая РА: - в пробирках; - учитывается через 2 часа выдерживания при 37 С и на следующий день стояния при комнатной температуре. - применяется с целью идентификации микроба и обнаружения АТ в сыворотке крови.

Развёрнутая реакция агглютинации: необходимые ингредиенты, порядок постановки, необходимые контроли, учёт результатов. К серии разведений сыворотки крови добавляют диагностикум - взвесь убитых микроорганизмов или частицы с сорбированными Аг. Максимальное разведение, дающее агглютинацию Аг, называют титром сыворотки крови. Рядом ставят контроль: вместо сыворотки наносят каплю раствора натрия хлорида. Агглютинацию учитывают по количеству осадка и степени просветления жидкости.

Одновременно учитывают контроли: сыворотка, разведенная изотоническим раствором натрия хлорида, должна быть прозрачной, взвесь микробов в том же растворе - равномерно мутной, без осадка.

Реакция преципитации (РП) – это осаждение растворимого антигена при действии антител в присутствии электролита. Видимый эффект реакции (феномен преципитации) – помутнение (образование мутного кольца или осадка – преципитата). РП применяют для обнаружения неизвестного антигена при ряде инфекционных заболеваний: при сибирской язве, туляремии, менингите, оспе. В судебной медицине ее используют для определения видовой принадлежности крови, спермы; в санитарно-гигиенических исследованиях – для установления фальсификации пищевых продуктов. РП отличается очень высокой чувствительностью и позволяет обнаружить антиген в разведении 1:1 000 000 и 1: 10 000 000.

Способы постановки РП.

1. Реакция кольцепреципитации – проводится в специальных преципитационных пробирках (диаметр – 0,4-0,5 см, высота – 7-8 см). В пробирку вносят 0,2 – 0,3 мл преципитирующей сыворотки и по стенке длинным носиком пастеровской пипетки осторожно наслаивают такое же количество преципитиногена. Затем осторожно из горизонтального положения пробирки ставят вертикально.

Учет результатов реакции проводят по появлению белого кольца на границе антиген-антитело. При положительной реакции наблюдается образование такого кольца. В этом случае антиген соответствует антителу и происходит их связывание.

Если в качестве преципитиногена используют прокипяченные и профильтрованные водные кстракты органов и тканей, то реакция называется реакцией термокольцепреципитации (например, при диагностике сибирской язвы).

2. Реакция преципитации в геле – проводится в чашках Петри или на предметных стеклах, куда помещают слой агарового геля. При застывании геля в нем вырезают лунки, в которые помещают антигены или антитела, или и то и другое. Различают 2 метода РП в геле:

а) метод простой (радиальной) иммунодиффузии: один из компонентов реакции иммунитета (антиген или антитело) помещают в лунку, а другой компонент – смешивают с агаром; при положительном результате (антиген соответствует антителу) вокруг лунки образуется кольцо преципитата;

б) метод двойной иммунодиффузии: и антитело и антиген помещают в отдельные лунки, они диффундируют в агаровом геле навстречу друг другу; при положительном результате на месте встрече антитела и антигена образуются линии преципитации

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА) основана на использовании эритроцитов (или латекса) с адсорбированными на их поверхности антигенами или антителами, взаимодействие которых с соответствующими антителами или антигенами сыворотки крови больных вызывает склеивание и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка.

Для постановки РНГА могут быть использованы эритроциты барана, лошади, кролика, курицы, мыши, человека и другие, которые заготавливают впрок, обрабатывая формалином или глютаральдегидом. Адсорбционная емкость эритроцитов увеличивается при обработке их растворами танина или хлорида хрома. Антигенами в РНГА могут служить полисахаридные АГ микроорганизмов, экстракты бактериальных вакцин, АГ вирусов и риккетсий, а также другие вещества.

+Эритроциты, сенсибилизированные АГ, называются эритроцитарными диагностикумами. Для приготовления эритроцитарного диагностикума чаще всего используют эритроциты барана, обладающие высокой адсорбирующей активностью.

Применение. РНГА применяют для диагностики инфекционных болезней, определения гонадотропного гормона в моче при установлении беременности, для выявления повышенной чувствительности к лекарственным препаратам, гормонам и в некоторых других случаях.

Механизм. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) отличается значительно более высокой чувствительностью и специфичностью, чем реакция агглютинации. Ее используют для идентификации возбудителя по его антигенной структуре или для индикации и идентификации бактериальных продуктов — токсинов в исследуемом патологическом материале. Соответственно используют стандартные (коммерческие) эритроцитарные антительные диагностикумы, полученные путем адсорбции специфических антител на поверхности танизированных (обработанных танином) эритроцитов. В лунках пластмассовых пластин готовят последовательные разведения исследуемого материала. Затем в каждую лунку вносят одинаковый объем 3 % суспензии нагруженных антителами эритроцитов. При необходимости реакцию ставят параллельно в нескольких рядах лунок с эритроцитами, нагруженными антителами разной групповой специфичности. Через 2 ч инкубации при 37 °С учитывают результаты, оценивая внешний вид осадка эритроцитов (без встряхивания): при отрицательной реакции появляется осадок в виде компактного диска или кольца на дне лунки, при положительной реакции — характерный кружевной осадок эритроцитов, тонкая пленка с неровными краями.

Реакция нейтрализации токсина антитоксином

В основе этой реакции лежит способность специфической ан­титоксической сыворотки нейтрализовать экзотоксин.

Антитела иммунной сыворотки способны нейтрализовать повреждающее действие микробов или их токсинов на чувст­вительные клетки и ткани, что связано с блокадой микробных антигенов антителами, т. е. их нейтрализацией.

Реакцию нейтрализации (РН) проводят путем введения смеси антиген—антитело животным или в чувствительные тест-объекты (культуру клеток, эмбрионы). При отсутствии у животных и тест-объектов повреждающего действия микро­организмов или их антигенов, токсинов говорят о нейтрализу­ющем действии иммунной сыворотки и, следовательно, о спе­цифичности взаимодействия комплекса антиген—антитело.

+Для прове­дения реакции исследуемый материал, в котором предполагается наличие экзотоксина, смешивают с антитоксической сывороткой, выдерживают в термостате и вводят животным (морским свин­кам, мышам). Контрольным животным вводят фильтрат исследу­емого материала, не обработанный сывороткой. В том случае, если произойдет нейтрализация экзотоксина антитоксической сыво­роткой, животные опытной группы останутся живыми. Конт­рольные животные погибнут в результате действия экзотоксина.