Литусов Н.В. Частная микробиолгия

221

С. Китасато выделил возбудителя из тканей умершего от чумы человека, а А. Йерсен - как из органов погибших от чумы людей, так и из органов павших крыс. А. Йерсен также впервые установил, что при пересевах на питательных средах возбудитель утрачивает патогенные свойства, а ослабленная культура в малых дозах способна защищать животных от чумы. В честь А. Йерсена возбудитель получил название Yersinia pestis.

В 1896 г. чума дошла до индийского города Бомбей. По просьбе властей в Бомбей из Парижа прибыл сотрудник Пастеровского института В.А. Хавкин (рисунок 3.113), разработавший к тому времени вакцину против чумы – так называемую лимфу Хавкина.

Рисунок 3.113 - Владимир Аронович Хавкин (1860-1930 гг.). Заимствовано из Интернет-ресурсов.

За короткое время В.А. Хавкин наладил производство вакцины. Для приготовления вакцины чумной микроб выращивали в мясном бульоне, а полученную культуру инактивировали прогреванием в течение часа при температуре 65ОС. Введение лимфы Хавкина грызунам защищало их от чумы. Для производства вакцины в Бомбее была создана противочумная лаборатория. Приготовленная вакцина широко использовалась для вакцинации населения против чумы.

С целью предупреждения завоза чумы в Россию в 1897 г. была создана особая правительственная комиссия – КОМОЧУМ, а в Императорском институте экспериментальной медицины (г. Санкт-Петербург) была создана чумная лаборатория. Так как работа с чумным микробом требовала строгой изоляции, лабораторию разместили в Кронштадском форте “Император Александр I” (рисунок

3.114).

222

Рисунок 3.114 - Форт “Император Александр I” и находящаяся в нем лаборатория по производству противочумных препаратов. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

В этой лаборатории было организовано производство чумной вакцины по методу Хавкина и противочумной сыворотки. В 1918 г. лабораторию из Кронштадского форта перевели в г. Саратов, где был открыт бактериологический институт с противочумным уклоном - в настоящее время Российский научноисследовательский противочумный институт “Микроб”.

Перед началом третьей пандемии чумы в Китае наблюдали массовую миграцию и гибель крыс. Вслед за эпизоотией стали наблюдаться заболевания чумой людей. Возникло предположение, что существует прямая связь между болезнью грызунов и заболеванием людей. В 1898 г. французский ученый П.-Л. Симон выделил возбудителя чумы из трупов крыс и экспериментально установил возможность передачи чумных бактерий блохами между крысами (рисунок 3.115).

Рисунок 3.115 - Поль-Луи Симон (Paul-Louis Simond, 1858-1947 гг.) и его эксперимент по изучению факта передачи возбудителя чумы блохами между

крысами. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

В 1899 г. российский эпидемиолог и микробиолог Д.К. Заболотный (рисунок 3.116) предположил, что в природе возбудитель чумы сохраняется в организме различных грызунов.

223

Рисунок 3.116 - Даниил Кириллович Заболотный (1866-1929 гг.). Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Его предположение подтвердилось в 1911 г. во время эпидемии легочной чумы в Маньчжурии, куда прибыла русская экспедиция во главе с Д.К. Заболотным. Во время экспедиции возбудитель чумы был выделен из органов сурка - тарбагана. В последующем возбудитель был выделен из органов суслика, и установлена возможность передачи чумного микроба человеку от грызунов.

Для защиты от чумы французские ученые Л. Оттен, Ж. Жирар и Ж.-М. Робик разработали живые противочумные вакцины на основе аттенуированных штаммов, полученных путем длительных пересевов бактерий на питательных средах. В результате проведенных исследований Л. Оттен создал противочумную вакцину на основе штамма TJW (рисунок 3.117).

Рисунок 3.117 - Приготовление живой чумной вакцины в лаборатории Л. Оттена на о. Ява. Справа - Л. Оттен с помощниками. Заимствовано из Интернет-

ресурсов.

Ж. Жирар и Ж.-М. Робик (рисунок 3.118) проводили исследования с вакциной, полученной на основе штамма EV.

224

A Б

Рисунок 3.118 – А - Жорж Жирар (Georges Girard, 1888-1985 гг.); Б - Жан-

Мари Робик (Jean-Marie Robic). Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Для получения вакцины Ж. Жирар использовал штамм, выделенный в 1926 г. из организма человека, погибшего от бубонной формы чумы. Путем ежемесячных пересевов в течение 5 лет на агаре при температуре 18-20ОС был получен штамм EV (инициалы погибшего человека), утративший патогенные свойства, но обладающий иммуногенностью. В 1933 г. вакциной EV было привито 13 тысяч человек. По своей эффективности вакцина EV превосходила не только убитую вакцину, но и вакцину Л. Оттена. В 1936 г. штамм EV был передан Ж. Жираром в СССР. До настоящего времени этот штамм используется для приготовления живой противочумной вакцины.

В1934 г. в бывшем Советском Союзе М.П. Покровская в Ставропольском научно-исследовательском противочумном институте получила вакцинный штамм чумного микроба путем обработки культуры бактериофагами. Полученную вакцину М.П. Покровская с сотрудниками испытали на себе, а затем использовали при ликвидации вспышки чумы в Монголии.

Внастоящее время ежегодно число заболевших чумой людей составляет около 2,5 тысяч человек. По данным ВОЗ, с 1989 г. по 2004 г. в 24 странах Азии, Африки и Америки было зафиксировано около 40 тысяч случаев заболеваний людей чумой, причем смертность составила около 7% от числа заболевших. Последняя эпидемия легочной чумы в России возникла в 1921 г. в Приморском крае. С 1979 г. на территории России случаи заболевания людей чумой не зафиксированы. В то же время в 2001-2003 гг. в Республике Казахстан зарегистрировано 7 случаев заболевания людей чумой (1 летальный случай), в Монголии – 23 случая заболевания (3 летальных случая), в Китае в 2001 – 2002 гг. чумой заболело 103 человека (9 летальных исходов). В настоящее время эпидемическая ситуация по чуме в сопредельных с Российской Федерацией территориях остается напряженной.

Таксономическое положение. Возбудитель чумы относится к типу

Proteobacteria, классу Gammaproteobacteria, порядку Enterobacterales, семейству Yersiniaceae, роду Yersinia, виду Yersinia pestis. Чумная палочка несколько раз меняла свое название: вначале она называлась Bacterium pestis, затем - Bacillus pestis, Pasteurella pestis, а с 1967 г. она стала называться Yersinia pestis в честь А.

Йерсена. По способности ферментировать глицерин и мелибиозу выделяют три биовара возбудителя:

225

-antigua (античный биовар) – ферментирует глицерин, не ферментирует мелибиозу, распространен в Центральной Азии и Центральной Африке;

-medievalis (средневековый биовар) – ферментирует глицерин и мелибиозу, распространен в Средней Азии и Иране;

-orientalis (восточный биовар) – не ферментирует глицерин и мелибиозу, распространен повсеместно.

Биовар antigua считают возбудителем Юстиниановой чумы, биовар medievalis связывают с “Черной смертью” (второй пандемией чумы), а биовар orientalis - с третьей пандемией чумы и большинством современных вспышек заболевания. Характеристики биоваров не являются стабильными. Штаммы, выделенные из разных очагов чумы, отличаются по ряду признаков от описанных биоваров.

Отечественная (российская) классификация выделяет следующие подвиды возбудителя чумы:

-pestis – основной подвид;

-altaica – алтайский подвид;

-caucasica – кавказский подвид;

-hissarica – гиссарский подвид;

-udegeica – удэгейский подвид.

Эта классификация является национальной и не включена в Международную номенклатуру бактерий.

Морфологические и тинкториальные свойства. Y. pestis представляет собой неподвижную грамотрицательную палочку овоидной (бочкообразной) формы, размером 0,3-0,6 x 1-2 мкм (рисунок 3.119).

а б

Рисунок 3.119 - Y. pestis, окраска по Граму (а) и электронная фотография возбудителя (б). Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Чумная палочка спор не образует. Характерным признаком чумного микроба является биполярная окраска. Биполярность особенно четко выражена в мазках, приготовленных из органов человека или грызунов и окрашенных метиленовым синим по Лёффлеру (рисунок 3.120).

226

Рисунок 3.120 - Окраска чумного микроба метиленовым синим по Лёффлеру. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Возбудитель чумы имеет нежную капсулу (рисунок 3.121).

Рисунок 3.121 - Капсула чумного микроба. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Культуральные свойства. Чумной микроб является факультативным анаэробом. Растет на простых питательных средах (МПА, МПБ, агар Хоттингера, агар Мартена) при рН 6,9-7,2. Оптимальная температура роста 27-28°С, но может расти в диапазоне температур от 2 до 40°С. Например, в организме блохи возбудитель размножается при температуре внешней среды, а в организме млекопитающих – при температуре 37ОС. Капсула образуется при выращивании микроба при температуре 37ОС.

Для ускорения роста в питательные среды добавляют стимуляторы роста: сульфит натрия, кровь. При росте на плотных питательных средах через 8-12 часов появляются сероватые слизистые мелкие колонии с неровными краями в виде “битого стекла”. Через 18-24 часа инкубирования формируются плоские колонии с фестончатыми краями (“кружевные платочки”). Через 40-48 часов выращивания образуются крупные колонии с зернистым центром и неровными краями - “ромашки” (рисунок 3.122).

227

Рисунок 3.122 - Характер роста чумного микроба на кровяном агаре. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Характерным признаком чумного микроба является вязкая консистенция колоний на плотной питательной среде (рисунок 3.123).

Рисунок 3.123 - Вязкий характер роста культуры чумного микроба. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

В жидких средах возбудитель чумы растет в виде поверхностной пленки, от которой вниз спускаются нити, напоминающие сталактиты; на дне образуется хлопьевидный осадок. Среда остается прозрачной (рисунок 3.124).

228

Рисунок 3.124 – Характер роста чумного микроба в жидкой питательной среде. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Биохимическая активность. Чумной микроб синтезирует плазмокоагулазу, фибринолизин, гемолизин, лецитиназу, гиалуронидазу, РНКазу. Протеолитические свойства выражены слабо: возбудитель чумы не разжижает желатин, не свертывает молоко, индол не образует. Не ферментирует рамнозу и сахарозу, ферментирует декстрин, глюкозу, маннозу, маннит, мальтозу, арабинозу, салицин, ксилозу, эскулин с образованием кислоты без газа.

По способности ферментировать глицерин чумной микроб подразделяется на хемовары: разлагающие глицерин штаммы (глицеринопозитивные) и не разлагающие глицерин штаммы (глицеринонегативные).

Антигенная структура. У чумного микроба выделяют следующие антигены:

-F1-антиген - поверхностный капсульный антиген, препятствующий фагоцитозу, обладающий протективными свойствами, кодируется плазмидой токсигенности pYT;

-LCR – Vi-антиген, состоит из белка (V-фракции) и липопротеина (W- фракции). Запускает экспрессию Yop-белков при повышенной температуре среды

(37 С); V-антиген - белок клеточной стенки, обладающий антифагоцитарными свойствами и способствующий внутриклеточному размножению бактерий; W- антиген - липопротеин клеточной стенки, оказывающий антифагоцитарное действие;

-О-антиген - эндотоксин микроба, оказывающий пирогенное действие;

-активатор плазминогена – протеаза, активирующая лизис фибриновых сгустков;

-мышиный токсин – белковоподобное внутриклеточное вещество, обладающее токсическими свойствами, фактор колонизации кишечника блохи, кодируется плазмидой токсигенности pYT;

-пестицины – бактериоцины, обладающие иммуногенными свойствами;

-Yop-белки: YopH ингибирует респираторный взрыв в фагоцитах; YopT разрушает актин; YopP вызывает апоптоз клеток. Yop-белки кодируются также плазмидой pYV.

Чумной микроб имеет антигены, общие с антигенами эритроцитов О-группы крови человека.

Резистентность. Чумной микроб обладает психрофильностью, то есть способностью размножаться при низких температурах. При температуре минус 22°С бактерии сохраняют жизнеспособность до 4 месяцев, в замороженных трупах грызунов и в организме блох - до 1 года. В мокроте возбудитель сохраняется до 10 суток, на одежде и белье - несколько недель. В трупах людей возбудитель

сохраняется длительное время. При нагревании до 50°С микроб погибает в течение 30 минут, при 70ОС – в течение 10 минут, при кипячении – в течение нескольких минут. Прямой солнечный свет убивает возбудителя за 2-3 часа. Возбудитель чумы чувствительный к дезсредствам (сулеме, лизолу, фенолу) и ультрафиолетовому облучению.

Основные факторы патогенности чумного микроба.

229

Капсульный антиген Caf1 или F1 (capsular antigen fraction 1) является основным компонентом гликопротеиновой капсулы, которая образуется при температуре 37ОС. Капсула экранирует липополисахарид (ЛПС) клеточной стенки. Капсульный антиген Caf1 (F1) кодируется геном caf1, локализованном в плазмиде pYT (pFra).

Антиген рН6 или PsaA (pH six antigen) представляет собой антиген, формирующий пили адгезии при температуре 37ОС и рН < 6. Антиген рН6 кодируется генами psaABE, локализованными в бактериальной хромосоме.

Активатор плазминогена Pla (plasminogen activator) обладает протеолитическими свойствами, фибринолитической (при температуре 37ОС) и плазмокоагулазной (при 28ОС) активностями. Активатор плазминогена кодируется геном pla, локализованном в плазмиде pYP (pPst).

Белки наружной мембраны (Yop - Yersinia outer membrane proteins)

кодируются плазмидой pYV (pCad). Комплекс признаков, кодируемых этой плазмидой, рассматривают как вирулон Yop (инжектосому) – единую систему, позволяющую внеклеточно расположенным бактериям обезвреживать клетки защитной системы организма путем инъекции внутрь этих клеток бактериальных эффекторных протеинов. Эта система состоит из белков Yop и аппарата секреции III типа. Секреция белков Yop происходит непосредственно при контакте с эукариотическими клетками.

“Мышиный токсин” (Ymt, Tox, FII, Yersinia murine toxin, fraction II)

представляет собой белковоподобное вещество, вызывающее шок и гибель лабораторных животных. “Мышиный токсин” обладает способностью блокировать адренергические рецепторы и ингибировать дыхательную активность митохондрий, понижая активность НАДФ-редуктазы. Мышиный токсин кодируется геном ymt, локализованным в плазмиде pYT (pFra).

V-антиген (LcrV - low-calcium response V antigen) и W-антиген - эффекторы,

образующиеся при температуре 37ОС в условиях отсутствия в питательной среде ионов кальция. V-антиген является белком, способствующим внутриклеточному размножению и сохранению бактерий в фагоцитах. W-антиген является внеклеточным липопротеином. Он обеспечивает способность бактерий сохраняться в фагоцитах.

Бактериоцин-пестицин (Pst) и устойчивость к нему обеспечивают стабильное наследование плазмиды pYP (pPst). Они кодируются генами pst и pim, локализованными в этой плазмиде. В составе этой же плазмиде локализуется ген mob, обеспечивающий мобилизацию плазмиды к конъюгационному переносу.

Протеаза определяет способность чумного микроба лизировать фибриновые сгустки, препятствующие распространению возбудителя.

Плазмокоагулаза участвует в образовании вокруг микробной клетки фибринового сгустка (псевдокапсулы).

Нейраминидаза разрушает нейраминовую кислоту соединительной ткани и способствует распространению возбудителя по тканям.

Антигенная мимикрия проявляется в сходстве белков чумного микроба с клетками печени и селезенки человека.

Факторы патогенности чумного микроба детерминируются как хромосомными, так и плазмидными генами (pYT, pYP, pYV). Плазмида