Нейссера III. Микробиологическая диагностика

     Микробиологическую диагностику дифтерии проводят тремя методами: бактериоскопическим, бактериологическим, серологическим, основным из которых является бактериологический, успех которого в значительной степени зависит от своевременного и правильного взятия материала от больного. Это должен делать врач или специально подготовленные средние медицинские работники. При наличии клинических симптомов заболевания выделение токсигенных штаммов С. diphtheriae является абсолютным подтверждением диагноза дифтерии. Бактериологическому исследованию в обязательном порядке подвергаются все больные с подозрением на дифтерию. Материалом для исследования служат слизь и пленки из очагов воспаления, а также секрет из очагов патологического процесса. Сбор материала необходимо проводить в течение 3-4 ч (не позже 12 ч) с момента обращения больного. Для взятия материала используют сухие ватные тампоны, если посев будет проведен не позднее 2-3 ч после сбора материала. При транспортировке на дальние расстояния можно использовать тампоны, предварительно смоченные 5% раствором глицерина. Результаты исследования выдают через 48-96 час.

     В первый день проводится микроскопическое исследование. Из исследуемого материала, взятого одним квачом, готовят 2 мазка и окрашивают их по Граму и Нейссеру. При окраске по Граму зерна волютина не проявляются, но грамположительная окраска и характер расположения дифтерийных палочек позволяет косвенно отличить их от непатогенных коринебактерий, располагающихся параллельно друг другу.

     При окраске по Нейссеру в мазках обнаруживаются микробы палочковидной формы, располагающиеся в виде латинских букв L, X, V, Y, растопыренных пальцев рук или римских пятерки (V), десятки (Х). Палочки имеют соломенно-желтый, а зерна волютина (Бабеша-Эрнста) на концах – темно-синий цвет. Этот способ окрашивания позволяет отличить C. diphtheriae от C. pseudodiphtheriticum, у которых не обнаруживаются зерна Бабеша-Эрнста. Эти результаты микроскопического исследования рассматриваются как ориентировочные, так как в препарате могут быть и другие зернистые микробные клетки.

     В этот же день для бактериологического исследования производят посев на чашки с кровяным теллуритовым агаром (среды Клауберга, Тинсдаля или Бучина) и помещают в термостат.

     На второй день, через 18-24 ч инкубации в термостате просматривают посевы. На средах с теллуритом калия колонии дифтерийных бактерий окрашены в черный цвет разной степени интенсивности. Колонии дифтероидов влажные, выпуклые, коричневого или серого цвета. На среде Бучина колонии возбудителей дифтерии синего цвета, дифтероидов – бесцветные, а палочек Хоффмана – голубоватые. Для выделения чистой культуры часть отдельно лежащей подозрительной колонии пересевают на скошенный сывороточный агар, или свернутую сыворотку (среда Ру или Леффлера). Вторую половину колонии пересевают в виде бляшки на поверхность среды, для определения токсигенности и, не прожигая петли, производят посев уколом в пробирку со столбиком питательной среды с цистином (проба Пизу) для выявления фермента цистиназы.

     Определение токсигенности выделенной культуры в настоящее время проводится несколькими методами:

     - подкожным или внутрикожным заражением 0,5-1,0 мл бактериальной культуры морских свинок массой 250 г. За 24 ч до заражения одно животное иммунизируют дифтерийным антитоксином. При положительном результате неиммунизированные животные погибают в течение 3-5 сут.

     - заражением куриных эмбрионов или культур клеток с регистрацией последующего цитопатического эффекта. 

     - твердофазным ИФА с использованием антитоксинов, меченных пероксидазой. 

     - ПЦР и ДНК-зонды для обнаружения tох-оперона в бактериальной хромосоме.

     Однако наибольшее распространение получила реакция преципитации в геле по Илеку и Оухтерлони. На среду с пониженным содержанием Fe2+ (для более интенсивного токсинообразования) проводят посев исследуемого изолята. На выросшие колонии накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанной дифтерийным антитоксином. Образующийся токсин и антитоксин диффундируют в агар и в месте встречи образуют линии преципитации белого цвета, так называемые «усы» или «стрелы». Также используют модификацию этого метода. Полоску бумаги, пропитанную антитоксином (500 ME в 1 мл (МЕ – международная единица или ЕД – это единица измерения дозы вещества, основанная на его биологической активности), наносят на чашку, а исследуемые культуры засевают бляшками по обе стороны бумажной полоски. Контролем служит заведомо токсигенная культура, также посеянная «бляшкой». В результате встречной диффузии токсина и антитоксина в месте их контакта выпадает линия преципитации, сливающаяся с линией преципитации токсигенного штамма.

     На третий день со скошенного сывороточного агара или свернутой сыворотки приготовляют мазок, окрашивают, по Нейссеру, микроскопируют. Учитывают токсигенность – отмечают появление коричневого облачка вокруг темного стержня по ходу укола в среде Пизу (положительная проба из-за образования сероводорода и его взаимодействия с уксуснокислым свинцом), что характерно для роста дифтерийных микробов. Для изучения ферментативных свойств и установления типа возбудителя дифтерии производят посев в среды Гисса с глюкозой, сахарозой, крахмалом и в среду с мочевиной для определения наличия уреазы.

     На четвертый день окончательный положительный ответ дают при наличии типичных дифтерийных бактерий в мазках из чистой культуры, характерных колоний на средах с теллуритом калия, результата пробы на токсигенность и определения ферментативных свойств. Принадлежность выделенной культуры к C. diphtheriae можно установить в реакции агглютинации с поливалентной дифтерийной сывороткой. Однако многие нетоксигенные штаммы возбудителей дифтерии не агглютинируются этой сывороткой. С помощью типовых агглютинирующих дифтерийных сывороток можно установить серологический тип возбудителя.

     Серологический метод является вспомогательным. Применяют реакцию агглютинации. Сыворотки больных разводят 3% раствором натрия хлорида в соотношении 1: 100, 1: 200, 1: 400, 1: 800, 1: 1 600. К разведениям сыворотки добавляют специально приготовленный диагностикум (дифтерийная культура, смытая 3% раствором натрия хлорида и убитая 0,2% раствором формалина). Реакцию считают положительной при разведении сыворотки не менее 1:100. Используется также ИФА и реакция пассивной гемагглютинации с эритроцитарным бактериальным диагностикумом. Диагностическим считают титр 1: 80 и выше, если он регистрируется на второй неделе от начала болезни.

     Из молекулярно-генетических методов исследования применяют ПЦР, что позволяет определять tох-ген в минимально короткие сроки (4-5 ч). Для установления источников и путей распространения дифтерийной инфекции, слежения за структурой популяции возбудителя и прогнозирования эпидемиологического процесса используют риботипирование (поиск в геноме маркерных вариабельных родо- и видоспецифичных последовательностей).

     Фаготипирование. Для дифференциальной диагностики возбудителей используют набор из 9 коринефагов. С его помощью можно типировать большинство токсигенных и нетоксигенных штаммов биовара gravis.

Обследуя больного ребенка, у которого отмечалось повышение температуры до 38˚С, боли в горле при глотании, одутловатость лица, адинамия, грязно-белые пленки на миндалинах врач заподозрил дифтерию и госпитализировал его. Какими микробиологическими методами можно подтвердить или отвергнуть предполагаемый диагноз?

Микробиологическим+бактериологическим IV. ПРОФИЛАКТИКА И ПРОТИВОЭПИДЕМИЧЕСКИЕ МЕРОПРИЯТИЯ

     Профилактика дифтерии подразделяется на специфическую и неспецифическую. Специфическая профилактика включает в себя активную иммунизацию – самый эффективный метод профилактики дифтерии.

     Ранняя диагностика заболевания и госпитализация больных, проведение дезинфекции в очаге заболевания, выявление и лечение бактерионосителей ограничивают распространение инфекции. Эти мероприятия относятся к неспецифической профилактике дифтерии.

    Прививка от дифтерии детям является единственным и самым эффективным средством защиты от инфекции. Для вакцинации детей применяются как отечественные вакцины АКДС (АДС, АД), так и зарубежные вакцины (Пентаксим, Инфанрикс). Массовые профилактические прививки привели к решительному перелому в борьбе с инфекцией. Заболеваемость дифтерией с 1960 до 1976 годов снизилась более, чем в 430 раз.

     Главной мерой профилактики дифтерии является вакцинация. Ее высокая активность подтверждена мировым опытом. Правильная организация и качественное проведение прививок от дифтерии определяют успех борьбы с этим грозным заболеванием.

     В РФ прививки от дифтерии являются обязательными для всего детского населения. Они не только защищают детей от заболевания, но и создают ареал безопасности для взрослого населения.

     На эффективность прививки от дифтерии влияет соблюдение сроков ее проведения и качество вакцины. Немаловажную роль играет так же закаливание ребенка и его правильное вскармливание. У крепких малышей противодифтерийный прививочный иммунитет формируется значительно лучше. Привитые дети могут заболеть дифтерией, но заболевание у них протекает легко, без развития грозных осложнений и смертельного исхода.

     Прививка против дифтерии защищает от токсина, который вырабатывают бактерии, а не от самих бактерий. Поэтому привитой человек сам дифтерией не болеет, но при заражении может выделять бактерии в окружающую среду и представлять угрозу для не привитой части населения.

     Анатоксин, который применяется для вакцинации, является обработанным дифтерийным токсином. В процессе обработки устраняются патогенные свойства токсина, но сохраняются антигенные свойства. На введение анатоксина организм отвечает выработкой антител, которые нейтрализуют токсин, вырабатываемый дифтерийными палочками. Заболевание в этом случае либо не возникает, либо протекает в легкой форме.

     Для вакцинации детей применяются как отечественные вакцины АКДС (АДС, АД), так и зарубежные вакцины (Пентаксим, Инфанрикс).

• АКДС-вакцине принадлежит основная роль в профилактике дифтерии (А – анатоксин, Д – анатоксин дифтерийный, С – анатоксин столбнячный, К – взвесь убитых коклюшных бактерий).

• АДС – анатоксин без коклюшного компонента.

• АДС-М – анатоксин без коклюшного компонента с уменьшенной дозой.

• АД – анатоксин дифтерийный.

• АД-М – анатоксин дифтерийный с уменьшенной дозой.

     Проведение плановых прививок детям проводится путем многократного введения вакцины АКДС. Сроки проведения прививок соответствуют Национальному календарю прививок.

     В России дети начинают прививаться вакциной АКДС с 3-х месячного возраста. Далее через год или полтора проводится ревакцинация. При наличии противопоказаний или перенесенного коклюша, прививка от дифтерии проводится в возрасте 4-6 лет. При наличии относительных противопоказаний к прививке от дифтерии и сильных температурных реакциях на вакцину АКДС и АДС используют вакцину АДС-М.

     Родители должны знать календарь профилактических прививок и четко следить за его выполнением.

     Ревакцинацию (повторную вакцинацию) проводят вакциной АДС-М в возрасте 6 и 17-и лет, и далее 1 раз каждые 10 лет. После активной иммунизации организм человека в течение 10-и лет сохраняет способность быстро (за 2-3 дня) вырабатывать антитоксин в ответ на повторное введение препаратов, содержащих АД-анатоксин.

     Состояние восприимчивости к дифтерии выявляется по результатам реакции Шика, которая заключается во внутрикожном введении раствора дифтерийного токсина. Покраснение и папула размером более 1 см считается положительной реакцией и свидетельствует о восприимчивости к дифтерии. В случае отрицательной реакции говорят о невосприимчивости к дифтерии. Реакцию Шика сегодня используют только по эпидпоказаниям. На ее проведение уходит несколько дней. Однако несмотря на это она помогает определить степень восприимчивости к дифтерии лиц, находившихся в контакте с больным и уточнить их иммунный статус.

     У половины лиц, которые были ранее привиты от дифтерии, не развивается достаточно прочный иммунитет, что может привести к рецидивам заболевания.

     Побочные реакции на введение вакцины АКДС регистрируются крайне редко.

• Небольшая отечность и покраснение места введения являются нормальной реакцией на введение вакцины. Эти явления исчезают в течение 2-3 дней. Допустим прием антигистаминных препаратов (кларитин, тавегил и др.)

• Повышение температуры в постпрививочный период снимается приемом жаропонижающих средств.

• При большой температуре тела, судорогах и покраснении места введения вакцины до размеров 8 см в диаметре и более необходимо обратиться за медицинской помощью. Чаще всего побочное действие вакцины обусловлено наличием коклюшного компонента.

     Риск развития побочных реакций на прививку от дифтерии значительно меньше риска развития заболевания и осложнений у непривитых детей. Чем больше непривитых детей в коллективах, тем выше уровень циркуляции токсикогенных штаммов возбудителей дифтерии, что приводит к вспышкам заболевания, в том числе с развитием грозных осложнений.

    Борьба с бактерионосительством является вторым по значимости после вакцинации противоэпидемическим мероприятием.

    На бактерионосительство обследуются:

• все дети, поступающие в детские дошкольные учреждения и больницы,

• сотрудники лечебных учреждений,

• контактные лица из очагов дифтерии.

    Выявленные бактерионосители токсикогенных штаммов дифтерийных палочек изолируются и проходят курс антибактериального лечения. Обязательным условием излечения является устранение очагов хронической инфекции. Спустя 30 дней после установления носительства и лечения детям разрешено посещение детских учреждений. Бактерионосители нетоксикогенных штаммов не изолируются.

    Значимым компонентом профилактики дифтерии являются противоэпидемические мероприятия в очаге инфекции.

1. Больные дифтерией и больные с подозрением на заболевание госпитализируются в стационар инфекционной больницы. В стационаре больной помещается в боксированную палату. Выписка больного из стационара осуществляется после получения 2-х отрицательных результатов бактериологического исследования, проведенных после окончания антибиотикотерапии спустя 2 дня. Бактериологическое исследование проводится с интервалом в два дня.

2. После изоляции больного в очаге проводится заключительная дезинфекция.

3. Контактные лица осматриваются врачом и обследуются на бактерионосительство. После проведения дезинфекции в очаге и получении отрицательных результатов бактериологического исследования контактные дети допускаются к посещению детских учреждений, а взрослые – к работе в детских коллективах и предприятиях общественного питания. Наблюдение за контактными лицами длится 7 дней с момента проведения заключительной дезинфекции.

4. Выявленные бактерионосители подлежат лечению.

5. Непривитые дети и привитые, но не имеющие достаточно напряженного иммунитета в возрасте до 14 лет прививаются.

6. По решению врача некоторым не привитым детям, находившихся в контакте с больным дифтерией, вводится анатоксин и противодифтерийная сыворотка. Введение этих препаратов создает у ребенка кратковременный пассивный иммунитет.