1_MIKROBIOLOGIYa_metoda_1_Morfologia

6

1. Рассмотрение строения, химического состава и функций клеточной

стенки бактерий.

Клеточная стенка является структурным компонентом прокариотических клеток, располагается над цитоплазматической мембраной и выполняет ряд важных функций

(Табл. 5.).

В зависимости от особенностей строения клеточной стенки бактерии подразделяют:

при окрашивании по Граму на грамположительные (Гр+) и грамотрицательные (Гр-

);

при окрашивании по Цилю-Нильсену на кислотоустойчивые и некислотоустойчивые.

Таблица 5

2. Изучение техники и механизмов окрашивания микропрепаратов по Граму и Циль-Нильсену.

Окраска сложным методом по Граму

Техника окрашивания по Граму Окраска состоит из четырех этапов:

1)на фиксированный мазок накладывают фильтровальную бумагу, на которую наливают раствор генциан-виолета на 1-2 мин., затем раствор сливают;

2)обрабатывают мазок раствором Люголя 30-60 с. и, не промывая его водой, сливают раствор;

3)обесцвечивают мазок путем нанесения на стекло 95% спирта на 20-50 с, далее промывают препарат водой;

7

4) наливают на мазок фуксин Пфейффера, через 1-2 мин краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют с иммерсионной системой.

Механизм окраски по методу Грама

УГрам+ бактерий проницаемость клеточной стенки невысока, пептидогликан имеет около 40 слоев, толщину до 50 нм и составляет 30-40% сухой массы клеточной стенки. С ним связаны полимеры тейхоевых кислот, которые пронизывают клеточную стенку, «сшивая» отдельные слои в единую структуру. Тейхоевые кислоты способствуют стабилизации ионов магния на поверхности бактерии и тем самым прочному удержанию красителей. При окрашивании по Граму первый краситель – генциан-виолет – в комплексе

сраствором Люголя прочно удерживается в клеточной стенке и не вымывается из нее при обесцвечивании в этиловом спирте, придавая бактерии фиолетовый цвет. Наносимый в дальнейшем краситель (фуксин Пфейффера) уже не воспринимается клеткой. Грам + бактерии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет.

УГрам- бактерий пептидогликан имеет 1-2 слоя, толщину до 15 нм и составляет около 10% сухой массы клеточной стенки. Он покрыт наружной мембраной, в состав которой входит липополисахарид (ЛПС) и другие компоненты. ЛПС является фактором патогенности бактерий – эндотоксином. Наружная мембрана пронизана белками – поринами, что обусловливает высокую проницаемость клеточной стенки. Тейхоевые кислоты отсутствуют. При окрашивании по Граму генциан-виолет легко вымывается из клеточной стенки спиртом, а бактериальная клетка воспринимает второй краситель – фуксин Пфейффера - и окрашивается в красный цвет.

Существуют модификации метода Грама:

-по А.И.Синеву;

-по Г.П.Калине (для выявления менингококков).

При окраске по методу Синева мазок покрывают полоской фильтровальной бумаги, заранее пропитанной раствором генцианового фиолетового и высушенной, на бумагу наносят 2-3 капли воды и выдерживают 1-2 мин.

Примеры Грам+ и Грам- бактерий

Грам+:

1)большинство кокков:

Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк);

Streptococcus pneumoniae (пневмококк);

Sarcina flava (желтая сарцина);

Peptococcus, Peptostreptococcus;

2)спорообразующие палочки:

Bacillus anthracis (возбудитель сибирской язвы);

Bacillus subtilis (сенная палочка);

Bacillus cereus (картофельная палочка);

Сlostridium perfringens (возбудитель газовой гангрены);

Сlostridium tetani (возбудитель столбняка);

Сlostridium botulinum (возбудитель ботулизма);

3)аспорогенные (неспорообразующие) палочки:

Mycobacterium tuberculosis (возбудитель туберкулеза);

Mycobacterium leprae (возбудитель лепры);

Corynebacterium diphtheriae (возбудитель дифтерии);

4)актиномицеты.

Грам-:

8

1)кокки:

Neisseria meningitidis (возбудитель менингококковой инфекции);

Neisseria gonorrhoeae (возбудитель гонореи);

род Veilonella (возбудители раневых инфекций);

2)палочки:

Е.coli (кишечная палочка);

Salmonella typhi (возбудитель брюшного тифа);

Shigella dysentheriae (возбудитель дизентерии);

Francisella tularensis (возбудитель туляремии);

Yersinia pestis (возбудитель чумы);

Bordetella pertussis (возбудитель коклюша);

3)микоплазмы:

Mycoplasma pneumoniae (возбудитель пневмонии);

Mycoplasma hominis (условно-патогенный микроорганизм);

4)риккетсии: Rickettsia typhi (возбудитель эндемического сыпного тифа).

Окраска сложным методом по Цилю-Нильсену

Техника окрашивания по Цилю-Нильсену

Окраска состоит из трех этапов:

1)фиксированный мазок покрывают полоской фильтровальной бумаги и наливают на нее феноловый фуксин Циля (можно пользоваться фильтровальной бумагой, предварительно пропитанной красителем и высушенной). Мазок подогревают над пламенем горелки до появления паров, затем отводят в сторону для охлаждения и добавляют новую порцию красителя. Подогревание повторяют 2-3 раза. После охлаждения снимают фильтровальную бумагу и промывают препарат водой;

2)препарат обесцвечивают путем погружения или нанесения на него 5%-го раствора серной кислоты или 1% соляно-кислого спирта, далее промывают несколько раз водой;

3)окрашивают препарат водно-спиртовым раствором метиленового синего 3-5 мин, промывают водой и высушивают.

Механизм окраски по методу Циль-Нильсена Кислото- и спиртоустойчивость – это способность удерживать краситель при

обработке раствором серной кислоты или соляно-кислого спирта при окраске по ЦильНильсену. Она обусловлена химическим составом клеточной стенки патогенных микобактерий. В их клеточной стенке содержатся в большом количестве липиды, воска, оксикислоты (туберкулостеариновая, фтионовая, миколовая, миколеновая и др.). При окраске по Цилю-Нильсену очень плотную оболочку необходимо «разрыхлить» путем нанесения карболового фуксина Циля с подогреванием. Кислотоустойчивые бактерии прочно удерживают проникший в стенку краситель. При дальнейшем обесцвечивании препарата в кислоте или солянокислом спирте фуксин Циля не вымывается, придавая бактериям красный цвет. Наносимый после этого метиленовый синий уже не воспринимается клетками.

Некислотоустойчивые бактерии при обработке в кислоте теряют фуксин, обесцвечиваются и при докрашивании метиленовым синим приобретают голубой цвет.

Примечание: М. smegmatis устойчива к воздействию кислоты, но не спирта. Поэтому в случае использования солянокислого спирта при окрашивании по Цилю-Нильсена эти микроорганизмы приобретают голубой цвет, а патогенные микобактерии – красный.

9

Примеры кислотоустойчивых бактерий:

Mycobacterium tuberculosis (возбудитель туберкулеза);

Mycobacterium leprae (возбудитель лепры);

Mycobacterium smegmatis (нормальный обитатель слизистой мочеполового тракта).

3. Рассмотрение групп микроорганизмов, не имеющих клеточной стенки.

Утрата бактериями клеточной стенки под воздействием внешней среды (лизоцима, антибиотиков и др.) приводит к образованию:

протопластов;

сферопластов;

L-форм.

Они приобретают сферическую форму, независимо от исходной формы бактерии (палочки или кокки), но различаются по:

происхождению;

осмотической устойчивости;

способности к размножению.

Протопласты Протопласты образуются при полном удалении клеточной стенки у Гр+ бактерий.

Их клеточное содержимое ограничено от внешней среды только ЦМП. Протопласты сохраняют свою целостность и сферическую форму только в изотонической среде; в гипоили гипертоническом растворе - разрушаются. Они сохраняют способность к дыханию, синтезу белков, ферментов, спорообразованию; резистентны к бактериофагам, действию антител, антибиотиков. Они приобретают шаровидную, нитевидную формы, во много раз превышающие размеры исходных клеток. Не способны к размножению.

Сферопласты Сферопласты образуются при деструкции клеточной стенки Гр- бактерий. Сложная

организация клеточной стенки Гр- микроорганизмов приводит к ее частичному разрушению. Сферопласты сохраняют свою целостность и сферическую форму даже в неизотонической среде, так как они устойчивы к разнице осмотического давления между внутриклеточными и внеклеточными отделами. Не способны к размножению.

L-формы

Бактерии (как Грам+, так и Грам-) частично или полностью утратившие клеточную стенку, но сохранившие способность к размножению называются L-формами бактерий (названы в честь института им.Д.Листера, где были впервые выделены).

Подобная трансформация может быть спонтанной (например, у хламидий) или индуцированной (например, под воздействием β-лактамных антибиотиков, иммунных сывороток, ионизирующих излучении, факторов иммунитета – лизоцима, комплемента, некоторых ферментов-аутолизинов и аминокислот.

Выделяют стабильные и нестабильные L-формы: первые не способны к восстановлению синтеза клеточной стенки, а вторые реверсируют в исходные формы после удаления причинного фактора.

L-формы патогенных бактерий способны вызывать хроническую инфекцию, не реагируя на действие ряда антибиотиков, бактериофагов.

10

Примеры микроорганизмов, способных формировать жгутики

1.Бактерии, у которых жгутики расположены по всей поверхности ЦПМ - перитрихи:

Esherichia coli (кишечная палочка);

микроорганизмы рода Salmonella (возбудители сальмонеллезов);

Сlostridium botulinum (возбудитель ботулизма);

Сlostridium tetani (возбудитель столбняка) и др.

2.Бактерии, у которых жгутики расположены пучком на одном полюсе – лофотрихи:

Burkholderia pseudomallei (возбудитель мелиоидоза);

Burkholderia cepacia.

3.Бактерии, у которых жгутики расположены по одному или пучками с обоих полюсов клетки – амфитрихи:

Spirillum volutans.

4.Бактерии, имеющие один жгутик на полюсе клетки – монотрихи:

Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка);

Pseudomonas alcaligenes;

Vibrio cholerae (возбудитель холеры) и др.

Помимо микроскопических методов, наличие жгутиков косвенно (по подвижности бактерий) можно определить путем посевов в питательные среды:

«уколом» в столбик полужидкого агара;

в конденсационную воду скошенного агара (по методу Шукевича).

Пили

Ворсинки, или пили (фимбрии), - нитевидные образования, более тонкие и короткие, чем жгутики. Пили отходят от поверхности клетки и состоят из белка пилина. Известно несколько типов пилей.

Пили общего типа (адгезивные пили) отвечают за прикрепления к субстрату, питание и водно-солевой обмен. Они многочисленны - несколько сотен на клетку.

Половые пили (F-пили) - 1-3 на клетку, создают контакт между клетками, осуществляя между ними передачу генетической информации путем конъюгации.

Патогенные бактерии могут иметь закрученные пили, располагающиеся по полюсам клетки и обладающие антигенными свойствами. Такие пили осуществляют контакт бактерии с клеткой-хозяином и участвуют в образовании биопленки.

Многие пили являются рецепторами для бактериофагов.

Основной способ обнаружения фимбрий - электронная микроскопия

4. Рассмотрение строения, химического состава и функций капсулы бактерий.

Капсула бактерий является необязательной структурой бактериальной клетки и располагается поверх клеточной стенки (Табл.6).

Таблица 6

Если размер капсулы превышает диаметр самой бактериальной клетки или сопоставим с ним, капсула называется макрокапсулой. Она характеризуется упорядоченным фибриллярным строением, плотным прилеганием к клеточной стенке, возможностью выявляться при окрашивании по Бурри-Гинсу, может иметь как полисахаридную (у большинства микроорганизмов), так и полипептидную природу

(например, у В.anthracis).

В отличие от макрокапсулы микрокапсула имеет маленькую толщину, выявляется только при электронном микроскопическом исследовании в виде микрофибрилл, имеет мукополисахаридную природу. Микрокапсулу образуют, например, стафилококки, гонококки, менингококки, бордетеллы коклюша и др.

Слизистый чехол (внеклеточная слизь) не имеет упорядоченного строения, не плотно прилегает к клеточной стенке и поэтому легко отделяется от нее.

5. Изучение техники и механизмов окрашивания микропрепаратов по Бурри-

Гинсу.

Техника окраски капсул по методу Бурри-Гинса

Окраска состоит из двух этапов:

1)смешивают каплю взвеси микробных клеток с каплей туши и при помощи стекла со шлифовальным краем делают мазок таким же образом, как мазок крови, высушивают и фиксируют;

2)на мазок наносят водный раствор фуксина на 1-2 мин., промывают водой, высушивают на воздухе.

Механизм окраски по методу Бурри-Гинса

Капсулы не воспринимают анилиновые красители, т.к. они в основном состоят из воды. При использовании негативного метода окраски по Бурри-Гинсу капсулы выделяются на темно-розовом фоне в виде неокрашенных ободков вокруг красных тел бактерий.

Примеры микроорганизмов, образующих капсулу

Большинство бактерий, особенно патогенных, образуют капсулу только в организме человека или животных, однако существует род истинно капсульных бактерий, представители которого образуют капсулу и при культивировании на питательных средах

(род Klebsiella).

Бактерии, образующие капсулу и на питательных средах (in vitro), и в организме (in

vivo):

Klebsiella pneumoniae (возбудитель пневмонии);

Klebsiella rhinoscleromatis (возбудитель риносклеромы);

Klebsiella ozaenae (возбудитель озены).

Бактерии, образующие капсулу только в зараженном организме:

Streptococcus pneumoniae;

Bacillus anthracis (возбудитель сибирской язвы);

Сlostridium perfringens (возбудитель газовой гангрены);

Francisella tularensis (возбудитель туляремии);

Yersinia pestis (возбудитель чумы).

1.Рассмотрение строения, химического состава и функций включений бактерий.

Включения бактерий являются необязательной структурой бактериальной клетки и располагаются в цитоплазме (Табл.7)

Таблица 7

Включения бактерий

2. Изучение техники и механизма окрашивания микропрепаратов по методу Нейссера для выявления зерен волютина.

Техника окраски зерен волютина по Нейссеру

Окраска состоит из трех этапов:

1)фиксированный мазок окрашивают уксусно-кислым метиленовым синим 2-3 мин, сливают краситель;

2)наносят раствор Люголя на 20-30 с, далее сливают раствор и промывают мазок водой;

3)окрашивают препарат хризоидином или везувином 1-3 мин, после чего промывают водой и высушивают.

Механизм окраски зерен волютина по Нейссеру

Вследствие высокой концентрации полиметафосфатов и других соединений фосфора гранулы волютина обладают метахромазией – способностью окрашиваться в

цвет, отличный от основного красителя. При окрашивании по Нейссеру цитоплазма клеток, имеющая кислую реакцию, воспринимает щелочной краситель хризоидин и становится желтой, а зерна волютина имеют щелочную реакцию и окрашиваются синькой Нейссера в темно-синий цвет.

Выявление гранул волютина актуально при диагностике дифтерии.

Примеры микроорганизмов, имеющих включения (зерна) волютина:

Spirillum volutans;

Corynebacterium diphtheriae (возбудитель дифтерии);

Corynebacterium pseudodiphtheriticum (ложнодифтерийная палочка (палочка Гоффмана));

Corynebacterium acnes (недифтерийные коринебактерии);

Corynebacterium xerosis (недифтерийные коринебактерии).

3. Рассмотрение строения, химического состава и функций спор бактерий.

Спора является необязательной структурой бактериальной клетки и необходима для сохранения вида в условиях внешней среды (Табл. 8)

Таблица 8

4. Изучение техники и механизмов окрашивания микропрепаратов по методу Ожешко для выявления спор бактерий.

Техника окрашивания спор по методу Ожешко

Окраска состоит из нескольких этапов:

1)на нефиксированный мазок нанести 0,5% раствор хлороводородной кислоты и подогреть на пламени в течение 2-3 мин.;

2)кислоту слить, препарат промыть водой, просушить и фиксировать над пламенем. Затем окрасить по Цилю-Нильсену.

Механизм окраски по методу Ожешко

Последовательное нанесение хлороводородной кислоты, карболового фуксина Циля и нагревание приводит к «разрыхлению» очень плотной оболочки споры и проникновению в нее фуксина. Спора прочно удерживает краситель и при дальнейшем обесцвечивании препарата в кислоте фуксин Циля не вымывается, придавая бактериям красный цвет. Наносимый дадее метиленовый синий уже не воспринимается спорами.

Вегетативные формы бактерии при обработке в кислоте теряют фуксин, обесцвечиваются и при докрашивании метиленовым синим приобретают голубой цвет.

5. Рассмотрение особенностей строения и методов изучения морфологии микоплазм, хламидий, микоплазм, риккетсий, актиномицет, спирохет.

Микоплазмы и уреаплазмы

Микоплазмы и уреаплазмы – мелкие (0,3 – 0,8 мкм) Гр-бактерии, утратившие истинную клеточную стенку в процессе эволюции. Клеточную стенку им заменяет трехслойная клеточная мембрана, обеспечивающая осмотическую устойчивость бактерий.

В связи с отсутствием клеточной стенки для них характерен полиморфизм (разнообразие форм). Они могут иметь кокковидную, нитевидную, колбовидную, ветвящуюся формы, а также формировать псевдомицелий, обусловливающий их название (от греч. myces – гриб, plasma – нечто, имеющее форму). Не образуют спор, жгутиков.

Уреаплазмы отличаются от микоплазм более мелкими размерами и наличием уреазной (разложение мочевины) активности.

Примеры:

Mycoplasma pneumoniae (возбудитель ОРЗ и пневмонии);

Mycoplasma hominis (возбудитель инфекций урогенитального тракта);

Ureaplasma urealyticum (возбудитель инфекций урогенитального тракта).

Способы изучения морфологии:

световая микроскопия фиксированных мазков, окрашенных по РомановскомуГимзе, редко – по Граму;

электронная микроскопия.

Хламидии

Хламидии – мелкие сферические Гр- бактерии. Являются облигатными внутриклеточными паразитами, поскольку их собственная метаболическая активность слабая. Они не образуют АТФ и практически полностью зависят от клетки хозяина. Не растут на искусственных питательных средах. Не образуют спор, жгутиков, капсул.

Для хламидий характерен особый 2-х фазный цикл развития:

1)внеклеточные формы существования хламидий – элементарные тельца (ЭТ), они высоко инфекционны, не размножаются;

2)внутриклеточные репродуктивные формы – ретикулярные тельца (РТ); они малоинфекционны, способны многократно делиться, образуя характерные микроколонии внутри клетки хозяина.

Примеры:

Chlamydia trachomatis (возбудитель трахомы и заболеваний урогенитального тракта);

Chlamydophila pneumoniae (возбудитель пневмонии);

Chlamydophila psittaci (возбудитель орнитоза).

Способы изучения морфологии хламидий:

световая микроскопия фиксированных мазков, окрашенных по Романовскому-Гимзе, Макиавелло, метиленовым синим, редко по Граму;

электронная микроскопия.