1_MIKROBIOLOGIYa_metoda_1_Morfologia

Аллергологический метод позволяет выявить аллергические реакции, формирующиеся у человека в ответ на присутствие некоторых возбудителей, чаще всего путем постановки кожно-аллергических проб.

Молекулярно-биологические методы:

В настоящее время в микробиологической практике серьезные таксономические заключения уже нельзя строить только на основе изучения одного фенотипа, необходимо их подтверждение данными геносистематики. Генотип гораздо меньше подвержен действию внешних условий и при одном и том же генотипе в разных условиях возможно некоторое разнообразие фенотипов, поэтому признаки, характеризующие наследственный материал, более стабильны. В связи с этим широко используется следующие молекулярнобиологические методы диагностики:

1)секвенирование генов;

2)пульс-электрофорез;

3)геномная дактилоскопия;

4)газожидкостная хроматография;

5)масс-спектрометрия;

6)полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Использование молекулярно-генетических методов в большинстве случаев позволяет получать ответ через 2-6 часов после внесения исследуемого образца.

Микроскопические методы

Морфологию микроорганизмов традиционно изучают микроскопическими методами. Они включают приготовление мазков и препаратов, их окрашивание для микроскопирования.

В большинстве случаев результаты микроскопических исследований носят ориентировочный характер, т.к. многие возбудители лишены морфологических особенностей; они не позволяют установить родовую и видовую принадлежность микроорганизмов и являются одним из этапов бактериологического исследования.

Однако при некоторых заболеваниях микроскопия является самостоятельным методом диагностики:

-сифилис; -мягкий шанкр; -острая гонорея; -туберкулез;

-лепра;

-лептоспироз;

-возвратный тиф и некоторые другие.

Морфологию и ультраструктуру микроорганизмов можно изучать при использовании следующих видов микроскопии:

-биологическая (световая);

-темнопольная;

-фазово-контрастная;

-люминесцентная;

-электронная.

Световая микроскопия используется для изучения формы, размеров микроорганизмов, их взаимного расположения и отдельных структур микробных клеток. Микроскоп – оптический прибор, позволяющий наблюдать мелкие объекты.

В микроскопе различают механическую и оптическую части. 11

К механической части относятся: штатив (состоит из основания и тубусодержателя) и укрепленные на нем тубус с револьвером для крепления и смены объективов, предметный столик для препарата, приспособления для крепления конденсора и светофильтров, а также встроенные в штатив механизмы для грубого (макромеханизм, макровинт) и тонкого (микромеханизм, микровинт) перемещения предметного столика или тубусодержателя.

Оптическая часть микроскопа представлена объективами, окулярами и осветительной системой, которая, в свою очередь, состоит из расположенных под предметным столиком конденсора Аббе, зеркала, имеющего плоскую и вогнутую сторону, а также автономного или встроенного осветителя. Объективы ввинчиваются в револьвер, а окуляр, через который наблюдают изображение, устанавливают с противоположной стороны тубуса. Различают монокулярный (имеющий один окуляр) и бинокулярный (имеющий два одинаковых окуляра) тубусы.

Конденсор, расположенный между источником света и изучаемым объектом, собирает лучи света в поле микроскопа. Объектив создает изображение поля внутри тубуса. Окуляр увеличивает это изображение и делает возможным его восприятие глазом.

Основную роль в получении изображения играет объектив.

В зависимости от среды, которая находится между объективом и препаратом, различают сухие объективы малого и среднего увеличения (до 40 х) и иммерсионные с увеличением 90-100 х.

В сухом объективе между фронтальной линзой и препаратом находится воздух, в иммерсионных - иммерсионная среда (вода или специальное масло), имеющая показатель преломления, близкий к стеклу, что обеспечивает увеличение разрешающей способности объектива.

Увеличение микроскопа ориентировочно можно определить, умножая увеличение объектива на увеличение окуляра. Однако увеличение не определяет качества изображения. Качество изображения, его четкость, определяется разрешающей способностью микроскопа, т.е. возможностью различать раздельно две близко расположенные точки. Разрешающая способность светового микроскопа 0,2 мкм.

Внимание! При фокусировке иммерсионный объектив опускают макровинтом, погружая его в иммерсионную среду почти до соприкосновения с препаратом при обязательном наблюдении сбоку, чтобы не повредить фронтальную линзу и сам препарат. Далее, глядя в окуляр, медленно поднимают объектив макровинтом до появления изображения и с помощью микровинта производят окончательную фокусировку микроскопа.

Фазово-контрастная микроскопия используется для микроскопии живых неокрашенных микроорганизмов, отличающихся от окружающей среды только по показателю преломления. В этом случае изменения интенсивности света (амплитуды), а изменяется только фаза прошедших световых волн. Фазово-контрастное устройство, которое может быть установлено на любом световом микроскопе, преобразовывает невидимых фазовые изменения, вносимые объектом, в амплитудные, различимые глазом. Оно состоит из набора объективов со специальными фазовыми пластинками и фазового конденсора.

Разрешающая способность фазово-контрастного микроскопа 0,2 мкм.

Темнопольная микроскопия используется для изучения подвижности микроорганизмов (например, возбудителя сифилиса, лептоспир, вибрионов и т.д.). Основана на способности микроорганизмов рассеивать свет во время передвижения в микропрепарате при сильном боковом освещении. Для создания «темного поля» зрения используются специальные парабалоидили кардиоид-конденсоры. Их центральная часть затемнена, поэтому прямые лучи от осветителя отсекаются, а в объектив попадают только

12

косые боковые лучи, рассеянные бактериями, находящимися в препарате. Микроорганизмы выглядят яркосветящимися на черном фоне.

Разрешающая способность темнопольного микроскопа 0,02 мкм, однако этот вид микроскопии позволяет увидеть только контуры объекта, но не дает возможности изучить его внутреннюю структуру.

Люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия

Основана на способности некоторых веществ люминесцировать, т.е. светиться при освещении невидимым ультрафиолетовым или синим светом.

Поскольку большинство микроорганизмов не обладают собственной фотолюминесценцией, существуют способы их обработки для наблюдения в люминесцентном микроскопе:

1)флюорохромирование – прямое окрашивание микроорганизмов сильно разведенными растворами флюоресцирующих красителей (флюорохромов), например, возбудителей туберкулеза (ауромином), дифтерии (корифосфином), включений в клетках, образуемых некоторыми вирусами (примулином) и др.;

2)метод флюоресцирующих антител (МФА) - серологическая реакция, результаты

которой учитываются в люминесцентном микроскопе.

При возбуждении люминесценции синим светом цвет ее может быть от зеленого до красного; если люминесценция возбуждается ультрафиолетовым излучением, то свечение может быть в любой части видимого спектра.

Основными частями являются:

1)осветитель с мощным источником света (ртутно-кварцевая лампа сверхвысокого давления или галогенная кварцевая лампа);

2)система светофильтров:

-первый светофильтр помещают перед источником света, он пропускает только возбуждающую коротковолновую область видимого спектра - синеили ультрафиолетовые лучи;

-второй (желтый) поглощает эти лучи и пропускает свет от люминесценции препарата, имеющий большую длину волны, чем возбуждающий; его устанавливают в тубусе или на окуляре микроскопа.

Спомощью люминесцентного микроскопа возможно изучить микроорганизмы как в живом, так и убитом состоянии и обнаружить их в исследуемом материале в малых концентрациях за счет высокой контрастности изображения. Это позволяет использовать люминесцентную микроскопию при экспресс-диагностике инфекционных заболеваний.

Электронная микроскопия

В электронном микроскопе вместо света для построения изображения используют поток электронов в глубоком вакууме. Их источником служит электронная пушка. В качестве «линз», фокусирующих электроны, служит электромагнитное поле, создаваемое электромагнитными катушками. Изображение в электронном микроскопе наблюдают на флюоресцирующем экране и фотографируют. В качестве объектов используют ультратонкие срезы микробов, тканей и др. толщиной 20-50 нм, которые размещают на специальных подложках - пленках коллодия, поскольку стекло не пропускает электроны. Разрешающая способность 0,15 нм, что позволяет получить полезное увеличение в миллионы раз. Наиболее широко применяются просвечивающая электронная микроскопия, позволяющая изучить вирусы, ультраструктуру бактерий, и сканирующая микроскопия, которая применяется для изучения поверхности объекта.

13

2. Способы приготовления нативных и фиксированных микропрепаратов

I. Нефиксированные препараты используют для исследования микроорганизмов в живом (нативном) состоянии. Их можно приготовить следующими способами:

-«раздавленная капля»;

-«висячая капля»;

-витальная (прижизненная) окраска.

Такие препараты применяются для изучения формы и подвижности бактерий, чаще всего с использованием темно-полевого, реже фазово-контрастного микроскопов.

II. Фиксированные окрашенные препараты применяют для изучения формы, размеров, взаимного расположения бактерий в пространстве, а также отдельных структур клетки с использованием светового, реже - люминесцентного микроскопов.

Этапы приготовления фиксированных препаратов из культур бактерий

1.Обезжиривание предметного стекла.

2.Нанесение на стекло капли жидкой культуры; если культура бактерий выращена на плотной питательной среде, предварительно на стекло наносят каплю физ.раствора или дистиллированной воды и в ней суспендируют культуру.

3.Высушивание мазка на воздухе или высоко над пламенем спиртовки.

4.Фиксация препарата.

Способы фиксации мазков:

-физический (в пламени) — наиболее часто используемый метод;

-химический (в жидкости) - используют при фиксировании мазков-отпечатков из тканей, по методу Гисса, Бурри-Гинса и некоторых других.

Вещества, используемые для химического способа фиксации мазков:

-этиловый спирт 95%, 10-15 минут;

-смесь равных объемов абсолютного спирта и эфира (по Никифорову), 10-15 минут;

-10% раствор нитрата серебра, 10 минут и др.

Цель фиксации:

-прикрепить микроорганизмы к стеклу;

-убить микроорганизмы;

-повысить тинкториальные свойства микроорганизмов (способность воспринимать окраску).

Методики приготовления мазков из клинического материала

1.Мазки из гноя, мокроты.

Небольшое количество материала наносят петлей на середину предметного стекла и покрывают вторым предметным стеклом так, чтобы оставить свободной треть первого и второго стекол. Стекла раздвигают в стороны и получают два больших мазка одинаковой толщины; высушивают, фиксируют обычным способом.

2. Мазки из крови готовят чаще всего по типу «толстая капля».

На середину предметного стекла наносят каплю крови и распределяют ее так, чтобы диаметр мазка соответствовал примерно 1,5-2см; высушивают на воздухе; фиксируют химическим методом, но если выявляемые бактерии подвержены деформации при фиксировании, то мазок не фиксируют.

3. Мазок из ликвора.

На середину предметного стекла наносят каплю ликвора из осажденного после центрифугирования слоя; высушивают на воздухе; фиксируют на пламени, но если выявляемые бактерии подвержены деформации при фиксировании, то мазок не фиксируют.

14

4.Препараты-отпечатки делают из внутренних органов трупов. Поверхность органа прижигают раскаленным скальпелем и из этого участка вырезают кусочек материала. Поверхностью среза прикасаются к стеклу в 2-3 местах; высушивают на воздухе; фиксируют химическим методом.

3.Простые методы окраски: назначение и техника окрашивания.

1.Простые (ориентировочные) методы дают возможность определить наличие бактерий в препарате, их форму, размеры и взаиморасположение клеток; для выполнения используется один краситель, позволяющий отличить микроорганизмы от фона.

Для простой окраски фиксированных мазков чаще используют:

-фуксин Пфейффера (карболовый фуксин Циля, разведенный водой 1:10); экспозиция 1-2мин; цвет, приобретаемый бактериями – красный;

-водно-спиртовой раствор метиленового синего; экспозиция 3-5мин; цвет, приобретаемый бактериями – голубой.

Для прижизненной окраски микроорганизмов используют метиленовый синий, нейтральный красный и другие красители в разведении 1:10000. Для этого готовят препарат по типу «раздавленная капля»: на предметном стекле смешивают каплю исследуемого материала с раствором красителя и накрывают покровным стеклом. Микроскопируют с объективом 40.

2. Сложные методы дают возможность дифференцировать одни микроорганизмы от других по составу и строению клеточной стенки (метод Грама, Циля-Нильсена) или выявлять отдельные структуры бактерий (методы Нейссера, Ожешко, Бурри-Гинса и др.); используются несколько красителей и реактивов, последовательно наносимых на препарат.

15

1. Морфология и структура бактериальной клетки.

Выделяют три основные формы бактерий.

1.Шаровидные или овальные – кокки.

2.Палочковидные (цилиндрические).

3.Извитые (спиралевидные):

-вибрионы (изогнутость тела не превышает четверти оборота спирали) и сходные сними по форме бактерии (например, кампилобактерии);

-спирохеты (имеются изгибы, равные одному или нескольким оборотам спирали) – трепонемы, боррелии, лептоспиры.

Кокки в мазке могут располагаться относительно друг друга следующим образом:

1)беспорядочно – (микрококки);

2)попарно (диплококки):

-ланцетовидной формы – Streptococcus pneumoniae (пневмококк);

-бобовидной формы - Neisseria meningitidis (менингококк);

-Neisseria gonorrhoeae (гонококк);

3)цепочками (стрептококки) – Streptococcus pyogenes (пиогенный стрептококк);

4)группами по четыре – тетракокки;

5)«пакетами» – по 8-16 клеток (сарцины) – Sarcina flava (желтая сарцина);

6)в виде «гроздей винограда» (стафилококки) - Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк).

Классификация палочек

I. По размеру:

1) мелкие (1-2 мкм) – возбудитель бруцеллеза – Brucella melitensis;

туляремии - Francisella tularensis; коклюша - Bordetella pertussis;

2) средние (2-4 мкм) – возбудитель дизентерии - Shigella dysentheriae;

брюшного тифа - Salmonella typhi; кишечная палочка - Esherichia coli;

1

3) крупные (более 4 мкм) – возбудитель сибирской язвы – Bacillus anthracis, cтолбняка – Сlostridium tetani.

II. По наличию спор:

1) собственно бактерии (не образуют спор) - E.coli, S.typhi, Klebsiella pneumonia;

2) бациллы (образуют споры):

а) собственно бациллы (спора располагается центрально и не превышает диаметр бактериальной клетки):

-возбудитель сибирской язвы – Bacillus anthracis;

-cенная палочка – Bacillus subtilis;

-картофельная палочка – Bacillus cereus.

б) клостридии (спора превышает диаметр бактериальной клетки и располагается субтерминально, терминально٭, редко – центрально):

-возбудитель газовой гангрены – Сlostridium perfringens;

-возбудитель cтолбняка – Сlostridium tetani (вид «барабанной палочки»);

-возбудитель ботулизма – Сlostridium botulinum (вид «теннисной ракетки»).

Примечание*: клостридии с терминально расположенной спорой (С.tetani) называют плектридиями.

III. По расположению в мазках:

1)хаотичное (у большинства палочек);

2)попарное (диплобактерии) - K.pneumoniae;

3)цепочкой:

-стрептобациллы – B.anthracis;

-стрептобактерии – Haemophilus ducreyi (возбудитель мягкого шанкра);

4) под углом (в виде римских X, V) – Corynebacterium diphtheriae.

Хаотичное или упорядоченное (в виде групп) расположение микроорганизмов в мазках зависит от плоскости деления и от активности ферментов-аутолизинов, контролирующих процесс

2

разделения клеточных стенок после деления и дальнейшее расхождение микроорганизмов в пространстве.

Существуют группы бактерий, имеющих особую форму:

-актиномицеты;

-микоплазмы и уреаплазмы;

-хламидии;

-риккетсии;

-спирохеты.

Некоторые палочковидные бактерии, особенно в неблагоприятных условиях (при культивировании патогенных бактерий на искусственных питательных средах, при проведении антибиотикотерапии и т.п.), могут образовывать нитевидные инволюционные формы - отдельные клетки соединяются с помощью слизи, мостиков или специальных полисахаридных футляров, в результате чего формируются нити (у гемофилов и др.) - или даже ветвящиеся формы (например, у микобактерий, коринебактерий).

В структуре бактериальной клетки выделяют обязательные органеллы, которые есть у любой бактерии и без которых клетка не может функционировать, и необязательные, наличие которых характерно для определенных видов (схема 1).

Схема 1. Органеллы бактериальной клетки

ОРГАНЕЛЛЫ БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКИ

Краткая характеристика органелл бактериальной клетки представлена в таблице 4

4

5