Презентации 2020 / 03-20-GP-SequencingHumanGenome
.pdf
Геномика и протеомика
Модуль 1. Клонирование, идентификация и анализ ДНК
Лекция 3. Секвенирование ДНК. Геном человека
•1.3.1. Химическая структура ДНК (повторение)
•1.3.2. Секвенирование ДНК: I поколение методов
•1.3.3. Автоматизация секвенирования ДНК
•1.3.4. Секвенирование ДНК следующих поколений (NGS)
•1.3.5. Стратегия секвенирования целых геномов
•1.3.6. Первый секвенатор NGS: пиросеквенирование 454
•1.3.7. Флуоресцентное секвенирование Illumina
•1.3.8. Международный проект «Геном человека»
Химическая структура ДНК и РНК
Пурины
Пиримидины
Генетическая информация записана в виде последовательности нуклеотидных остатков, которые содержат одно из 4-х азатистых оснований: аденина (A), цитозина (C), гуанина (G) и тимина (T). У некоторых фагов Т замещен урацилом (U - фаг PBS1), который обычно входит в состав РНК.
Химическая структура ДНК и РНК
Нуклеотид — основная структурная единица нуклеиновых кислот, их мономерное звено. Состоит из фосфата, сахара дезоксирибозы (ДНК) или рибозы (РНК) и одного из азотистых оснований. Последовательность оснований содержит генетическую информацию, а остатки моносахаридов и фосфорной кислоты играют структурную роль (носители, оснований). ДНК состоит из дезоксирибонуклеотидов.
Химическая структура ДНК и РНК
Нуклеозид — При частичном гидролизе нуклеотидов отщепляется остаток фосфорной кислоты и образуются нуклеозиды, молекулы которых состоят из остатка пуринового или пиримидинового основания, связанного с остатком моносахарида — рибозы или дезоксирибозы.
Структурная формула пуринового нуклеозида
Химическая структура ДНК и РНК
Структурная формула цепи ДНК
В молекулах ДНК и РНК отдельные нуклеотиды связаны в единую полимерную цепь за счет образования сложноэфирных связей между остатками фосфорной кислоты и гидроксильными группами при 3- м и 5-м атомах углерода моносахарида.
•Длина цепи ДНК – 1-2 м для млекопитающих
•<1 млн для большинства бактерий
•5 млн для E.coli
•3 биллиона для человека и мыши
Секвенирование ДНК, I поколение
Основные методы секвенирования небольших фрагментов ДНК:
I.Химическая деградация (1976 г метод Максама-Гилберта).
Сейчас применяется для малых фрагментов ДНК 10-100 bp
Этапы:
1) Рестрикция и выделение фрагмента
2) Мечение конца радиакт Р
3) Ограниченное химическое расщепление определенной связи после модификации: в результате весь набор длин фрагментов
Ограничения:
1) Трудоемкость
2) Токсичность реагентов
3) Малый размер фрагментов – до 400 нуклеотидов
Геномика и протеомика
Секвенирование ДНК, I поколение
Основные методы секвенирования небольших фрагментов ДНК:
II. Ферментативный с использованием дидезоксинуклеотидов-терминаторов (метод обрыва цепи или метод Сэнгера, 1975 г.)
Структура терминаторов:
Геномика и протеомика
Секвенирование ДНК по Сэнгеру
ферментативный с использованием дидезоксинуклеотидов
Мечение ДНК для фиксации сиквенса:
1)Праймер – 5’ (радиоакт Р)
2)терминаторы
Фиксация результата:
1) Гель-электрофорез по 4-м дорожкам
Недостатки:
1)Получение
одноцепочечной матрицы (до ПЦР)
2)Трудоемкость чтения результата
3)Размер до ~800 нуклеотидов
Геномика и протеомика
Секвенирование ДНК
Ферментативное секвенирование небольших фрагментов ДНК (сенгеровское): 40 – 1800 bp
Развитие метода секвенирования:
1)введение 4-х флуоресцентных красителя для терминаторов
2)Гель-электрофорез по 1 или 2 дорожкам – чтение до 1800 нукл
3)Капиллярный электрофорез – чтение до 500-1000 нукл
4)Применение односторонней ПЦР
5)Автоматизация всех этапов: нанесения, считывания, анализа
Геномика и протеомика
Стратегия секвенирование геномов de novo
1)Фрагментация ДНК
2)Создание библиотеки генов
3)Анализ больших фрагментов ДНК рестрикционным картированием
4)Прогулки по хромосоме
(направленное секвенирование)
5) Рэндом-секвенирование или шотган-метод (shotgun)
Контиги – набор перекрывающихся коротких фрагментов ДНК (contiguous)
Скаффолд – «ДНК-скелет» из контигов
спромежутками известной длины
Геномика и протеомика