Презентации 2020 / 01-20-GP-DNA-tech
.pdf
Геномика и протеомика
Модуль 1. Клонирование, идентификация и анализ ДНК
Лекция 1. Введение. Технологии рекомбинантных ДНК I
•1.1.1. Геномика и протеомика: предмет изучения и значение
•1.1.2 Ген и реализация генетической информации
•1.1.3. Рестриктазы и другие ферменты для молекулярного клонирования
•1.1.4. Полимеразная цепная реакция (PCR)
•1.1.5. Общая схема молекулярного клонирования
•1.1.6. Клонирующие векторы: основные типы
•1.1.7. Общая схема вектора на примере бактериальной экспрессионной плазмиды
•1.1.8. Доставка рекомбинантной ДНК и РНК в клетку
Геномика и протеомика: предмет изучения
• Сравнение
Геномика |
Протеомика |
Исследует геномы организмов. Транскриптомы. |
Исследования совокупных белков организма – |
|
протеома. |
|
|
Картирование, секвенирование и анализ генома |
Характеризация всех белков организма или |
|
исследование структуры и функции белка |
|
|
Разделяется на структурную и функциональную |
Разделяется на структурную, функциональную |
геномику: |
и экспрессионную протеомику: |
1) Изучение структуры всех генов и их организации |
1) Изучение структуры всех белков и их |
на хромосоме |
распределение в клетке |
2) исследование функции всех генов и их роли в |
2) исследование функции всех белков, их |
регуляции метаболитической активности клетки |
взаимодействие друг с другом и с другими |
|
биомолекулами. Совокупность метаболических |
|
путей клетки – метаболом. |
|
3) Изучение качественное и количественное |
|
уровней экспрессии белков в клетке на различных |
|
стадиях развития организма и в различных |
|
условиях |
|
|
Геномика и протеомика: методы
• Сравнение
Геномика |
Протеомика |
Основные методы геномики: |
Основные методы протеомики: |
1) прямое секвенирование генов и полногеномное |
1) выделение белков, электрофоретическое |
секвенирование; |
разделение, расщепление на мелкие фрагменты, |
2) конструирование и идентификация |
масс-спектрометрия для определения |
экспрессионных фрагментов (EST) |
последовательностей, финальная идентификация |
3) Анализ и интерпретация данных |
белков по стандартным базам данных . |
секвенирования при использовании баз данных и |
2) ) предсказание и идентификация |
программного обеспечения. |
пространственной структуры белков |
|
3) исследование экспрессии белков и |
|
экспрессионных профилей клеток на микрочипах |
|
(микроэрреи) |
|
|
Секвенирование и аннотация геномов многих |
Протеомные базы данных, например, SWISS-2D, |
организмов, включая геном человека. |
PEP и т.д., программное обеспечение для поиска |
|
новых лекаств. |
Что такое ген?
•Ген – транскрибируемый фрагмент ДНК (или РНК), кодирующий полипептид или функциональные РНК: (рРНК, тРНК, мРНК, малые ядерные РНК).
•Безусловные структурные признаки: наличие промотора и терминатора
•Основная догма молекулярной биологии:
обратная транскрипция
ДНК РНК Белок
транскрипция трансляция
Носителем генов может быть ДНК и РНК (вирусные геномы).
ДНК, В-спираль
Общая структура гена
Промотор – сайт инициации |
Терминатор транскрипции |
|
транскрипции РНК-полимеразой |
||
|
Ген
мРНК
Белок
N-конец |
С-конец |
Упрощенная схема структуры гена и его экспрессии. Обязательно наличие стартового кодона ATG (для Мет) и одного из стоп-кодонов для трансляции. Все это ограничивает открытую рамку считывания, кодирующую полипептид (если ОРС (ORF) не подвергается отбору, частота встречаемости стоп-кодонов ~1 на 20 кодонов). Большинство эукариотических генов в своем составе имееют интроны – некодирующие внутригенные вставки, удаляемые при созревании мРНК – сплайсинге.
Реализация генетической информации
обратная транскрипция
ДНК |
РНК |
трансляция белок |
|
транскрипция |
|
Транскрипция осуществляется ДНК-зависимой РНК-полимеразой - мРНК.
Трансляция мРНК происходит на рибосомах.
Обратная транскриптаза (ревертаза, РНК-зависимая ДНК-полимераза - RT) синтезирует ДНК по РНК. За открытие обратной транскрипции в 1970 Г. Темин и Д. Балтимор получили Нобелевскую премию. Вначале RT обнаружена у ретровирусов, затем у других: теломераза, ретротранспозонная RT у эукариот, retron у грамм-отрицательных бактерий.
Технологии рекомбинантных ДНК
Ферменты для молекулярного клонирования ДНК
- Рестриктазы,
-лигазы,
-ДНК- и РНК-зависимые ДНК-полимеразы,
-полинуклеотидкиназы и фосфатазы,
-различные нуклеазы,
-и другие ферменты для модификаций концов молекул ДНК и манипуляций с фрагментами ДНК
Геномика и протеомика
Технологии рекомбинантных ДНК
ПЦР
Полимераз -ная цепная реакция
3 цикла
Геномика и протеомика
Общая схема молекулярного клонирования
Пример: трансформаци ябактерий плазмидным вектором
Геномика и протеомика
Технологии рекомбинантных ДНК
Основные типы клонирующих векторов
Вектор: Ориджин репликации, селективный маркер, клонирующие сайты
I. Плазмидные
М13
II.Вирусные
-нитевидные бактериофаги: М13, fd, f1
-бактериофаг лямбда и космиды
-бакуловирусы
-ретровирусы, аденовирусы, SV40 и другие
Геномика и протеомика