Презентации 2020 / 03-20-GP-SequencingHumanGenome
.pdf
Секвенирование геномов de novo
4) Рэндом-секвенирование или шотган-метод (shotgun) и сборка ДНК
Геномика и протеомика
Сборка геномов с использованием референсного
Геномика и протеомика
Секвенирование ДНК следующих поколений (NGS)
Полногеномное секвенирование. |
(next generation sequencing) |
Общая схема:
приготовление библиотеки (дробление ДНК и лигирование адаптеров)
амплификация
индивидуальных фрагментов и отжиг праймеров
синтез цепи, комплементарной регистрация сигнала
секвенируемому фрагменту
интеграция сигнала, перевод в последовательность ДНК
(basecalling)
Геномика и протеомика
Секвенирование ДНК следующих поколений
Основные области применения:
1.Фундаментальные исследования
2.Секвенирование геномов человека - прогнозирование
3.Диагностика инфекционных болезней
4.Ретроспективный эпиданализ
5.Медицинская генетика
6.Пренатальная диагностика
7.Фармакогеномика и устранение побочных эффектов
8.Трансплантология
9.Биобезопасность
10.Контроль качества продуктов питания
11.Метагеномика
12.Селекционная работа
13.ДНК-генеалогия
14.Этногеномика
15.Палеогеномика
16.Идентификация человека по ДНК: определение отцовства, геномная дактилоскопия
17.Образование
Геномика и протеомика
Секвенирование ДНК следующих поколений (NGS)
Полногеномное секвенирование сегодня: Основные технологии:
Геномика и протеомика
Первый секвенатор NGS: 454 Life Science Inc. (GS20)
Самая первая из технологий NGS (пиросеквенирование)
|
платформа |
GS Junior |
GS FLX |
|
|
|
|
|
|
|
длина чтения |
400 |
800 |
|
|
|
|
|
|
|
число чтений, М |
0.1 |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
объем данных |
35 Мб |
700 Мб |
|
|
|
|
|
|
|
цена за запуск/ |
1 100/22 |
6 200/7 |
|
|
цена за Мб (в $) |
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
время работы |
10 часов |
24 часа |
|
|
|
|
|
|
|
Расцвет технологий 2005-2007 |
(Margulies et al. Nature 2005; 441.7089) |
||
|
Преимущества: |
|
|
|
•большая длина чтения (сравнимо с секвенированием по Сэнгеру)
•короткое время работы
•наименее чувствительна к GC-составу Недостатки
•неточность прочтения гомополимерных участков (более 4-х)
•высокая цена в расчете на нуклеотид
•в 2016 году прекращается поддержка
Геномика и протеомика
454 – принцип метода (пиросеквенирование)
ДНК фрагментируют и |
1 фрагмент ДНК |
Шарики с ДНК |
|
закрепляется на |
смешивают с |
||
лигируют адапторы |
|||
микро-шарике, |
эмульсией, |
||
к краям фрагментов |
|||
покрытой |
содержащей ДНК- |
||
|
|||
|
олигонуклеотидами, |
полимеразу и |
|
|
комплементарными |
dNTP и проводят |
|
|
концам адаптера |
ПЦР |
454 – принцип метода (пиросеквенирование)
Носитель – плашка с |
В лунки загружаются |
Также в лунки |
|
помещаются частицы с |
|||
множеством (> 1 000 |
шарики, на которых |
||
закрепленными на них |
|||
000) лунок |
закреплены фрагменты |
||
ферментами – АТФ- |
|||
|
ДНК |
||
|
сульфурилазой и |
||
|
|
||
|
|
люциферазой |
454 – принцип метода (пиросеквенирование)
Через лунки в заданном порядке пропускают реагенты (dNTP, люциферин, аденозинфосфосульфат)
При присоединении dNTP выделяется пирофосфат. Сульфурилаза преобразует пирофосфат + аденозинфосфосульфат в АТФ. АТФ используется для окисления люциферина люциферазой. Световой сигнал регистрируется фотокамерой.
Секвенирование путем синтеза с обратимым терминированием: Illumina
Самая распространенная из технологий NGS (~ 80% всех данных)
|
платформа |
HiSeq2000 |
HiSeq2500 |
MiSeq |
|
|
|
|
|
|
|
|
длина чтения |
100+100 |
150+150 |
300+300 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
число чтений, М |
2 500 |
600 |
15-25 |
|
|
|
|
|
|
|
|
объем данных |
600 Гб |
120 |
15 Гб |
|
|
|
|
|
|
|
|
цена за запуск/цена |
23 470/0.04 |
6 145/0.05 |
1600/0.14 |
|
|
за Мб (в $) |
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
время работы |
11 дней |
40 часов |
65 часов |
|
|
|
|
|
|
|
HiSeq2000 и HiSeq2500 – модификации одного и того же прибора. MiSeq существует также в варианте MiSeqDx – первый NGS-прибор, разрешенный для использования в
диагностике.
В начале 2014 г. появились два новых прибора – NextSeq500 и HiSeqX 10
HiSeq 2000 Лаборатория лесной геномики СибФУ (Крутовский К.В) и Центра защиты леса Красн. края