ТИ КОЖИ
Биоинженерия как подход к восстановлению кожи
Потеря кожи на большой площади наблюдается при острой травме, включая ожоговую травму, где кожная инженерия имеет особое значение. Ежегодно около 6 миллионов пациентов обращаются за медицинской помощью при ожогах. Пожары в домах составляют только 4% случаев госпитализации, но 70% погибших в основном связаны с травмой при вдыхании (Hasselgren, 1999). Было подсчитано, что от 5 до 10% поступивших пациентов нуждаются в поступлении в специализированное ожоговое отделение и по меньшей мере 1% умирает от полученных травм. Хотя число опасных для жизни ожоговых травм снизилось, а смертность значительно возросла (Roberts et al., 2012), такая помощь при ожогах остается значительным финансовым бременем. Оценка глубины ожоговой раны является ключом к лечению ран.
Раннее закрытие ран является ключом к снижению смертности от сепсиса и рубцовой заболеваемости. Первая попытка классификации глубины ожога была предпринята Жаном де Виго (1460–1525) из Италии в 1483 году, который распознал поверхностные и глубокие раны, но только в 1953 году Джексон руководил текущими классификациями (Jackson, 1953). Описание Джексона включает поверхностную частичную потерю кожи, глубокую частичную потерю кожи и полную потерю кожи, и он продолжил отмечать плохое и отсроченное заживление, связанное с последними двумя, рекомендуя пересадку кожи в этих случаях.
Хронические язвы на ногах, часто венозный застой в этиологии, представляют другие дефекты кожи; в этих ранах изменяется физиология сосудов и особенности старения клеток. Затраты на лечение таких язв трудно оценить, и оценки значительно различаются. Учитывая хроническую природу патологии, хотя это относительно небольшие дефекты кожи, общая стоимость на пациента может быть огромной.
СТРУКТУРА ЭПИДЕРМИСА
Эпидермис представляет собой многослойную клеточную структуру. Основным типом клеток, составляющим 95% от общего количества, является кератиноцит, терминально дифференцирующаяся клетка, которая постепенно перемещается от глубокой к поверхностной, а затем отшелушивается с внешней поверхности эпидермиса в виде кератиновой чешуйки. Морфологически эпидермис делится (от глубокого до поверхностного) на пять слоев: базальный, шиповатый слой \ спиносум (колючка), зернистый, блестящий и роговой (ороговевающий) (рис. 15.1).
Базальный слой (ростковый)
Из-за функциональности деление клеток активности кератиноцитов базальный и шиповатый слои объединены в ростковый слой Мальпиги. В норме процесс регенерации эпидермиса обеспечивает базальный слой, однако при повреждении шиповатый также может брать на себя камбиальную функцию.
Представлен базальными кератиноцитами, связанными десмосомами. Они находятся непосредственно на базальной мембране, с которой связаны полудесмосомами. В тонкой коже имеют цилиндрическую форму, в толстой — овальную. Имеют набор органелл общего назначения, тонофиламенты, тонофибриллы, формирующие опорную сеть, а также меланосомы. Меланосомы — гранулы меланина, защищающие от действия УФ-лучей, кератиноциты получают от меланоцитов.
Часть базальных кератиноцитов является камбиальными клетками. Кроме кератоноцитов и меланоцитов, в базальном слое имеются и другие клетки. Это клетки Лангерганса, Меркеля, Гринстейна, внутриэпидермальные Т-лимфоциты. Очень редко встречаются гранулоциты и тучные клетки. Ростковый слой включает в себя весь базальный слой и часть шиповатого.
Шиповатый слой
Образован шиповатыми кератиноцитами, расположенными в десять и более рядов. В нижних рядах встречаются клетки Лангерганса. Шиповатые кератиноциты имеют характерные отростки — «шипы», при помощи которых связаны друг с другом. Кроме органелл общего назначения имеются кератиносомы (гранулы Одланда) — видоизмененные лизосомы, окружённые мембраной и видоизмененный тонофибриллярный аппарат, образующий концентрические сгущения вокруг ядра. Его функция — механическая защита ядра клетки от повреждений.
Зернистый слой
Имеет 1-2 ряда вытянутых параллельно коже клеток. Количество органелл уменьшается, цитоплазма содержит гранулы кератогиалина, связанные с тонофибриллами. Здесь также имеются кератоносомы. Содержимое этих гранул высвобождается в верхних рядах зернистого слоя, где из него формируются пластинчатые структуры. Подобные структуры гидрофобны и препятствуют проникновению воды в подлежащие слои. Также здесь начинается синтез кератолинина и филагрина, за счет которых формируется кератогиалин и происходит дальнейшая кератинизация эпителия
Блестящий слой или цикловидный слой
При световой микроскопии клетки не выявляются, и этот слой выглядит как блестящая гомогенная полоска розоватого цвета. Он состоит из 1-2 рядов плоских клеток с невыраженными границами, лишённых ядер и органелл. Он хорошо развит на ладонях и подошвах.
Роговой слой
Роговой слой выполняет защитную функцию и живых клеток не имеет. Слой образован роговыми чешуйками — мёртвыми кератиноцитами, соединёнными интердигитациями их цитолемм. Толщина данного слоя напрямую зависит от интенсивности механической нагрузки. В норме является хорошим барьером для многих патогенов.
Cornified layer
Granular layer
Langerhans cell
Prickle cell layer
Basal cell layer
Dermal papilla
Rete ridges
ЖЖЖЖЖЖЖ
Клеточный цикл в эпидермисе начинается с асимметричного деления предполагаемой стволовой клетки (в эквиваленте области мышечной выпуклости наружного корневого влагалища волосяного фолликула и более глубоких глубоких гребней гладкой кожи). Эта клетка, по определению, дает начало всем кератиноцитам в эпидермисе, включая временную амплифицирующуюся популяцию, которая подвергается дальнейшей ограниченной пролиферации. Хотя описание, данное ранее, представляет линейную прогрессию от базальных слоев до роговицы, есть по крайней мере две другие модели, признанные из работы на животных моделях.
Кинетика эпидермальной пролиферации осложняется наблюдением, что постмитотические клетки могут быть очень активными метаболически и могут увеличивать массу ткани без увеличения числа клеток. Время оборота представляет собой время, необходимое для замены всей популяции клеток, и зависит от продолжительности клеточного цикла (времени между последовательными митозами) и фракции роста, то есть доли клеток, подвергающихся митозу. В нормальной коже человека суммарный эффект обоих параметров заключается в генерировании эпидермального времени оборота 52–75 дней.
кератинs
Цитоскелет кератиноцита состоит из трех групп филаментов: актина (диаметром 7 нм), тубулина (20–25 нм) и промежуточных филаментов (7–10 нм). Последняя группа содержит несколько признанных компонентов, включая виментин, десмин, ядерные ламинины и кератины, полипептидные молекулы, характерные для всех эпителиальных клеток и на которые приходится 65% конечной массы корнеоцита. Семейство кератинов состоит из более чем 30 отдельных членов и с помощью электрофореза разделяется на основные кератины (пронумерованные 1–8) и кислые кератины (пронумерованные 9–12), и соответствующие семейства генов которых называются соответственно типами I и II. Кератины соединяются в кислые / основные димеры, которые специфически экспрессируются в соответствии с физиологией и морфологией клеток. Например, простые эпителии характеризуются парой кератина K8 / K18, а стратифицированный эпителий - K5 / K14. Кроме того, кожа подошвы и ладони экспрессирует K9, дифференцированную кожу K1 / K10 и гиперпролиферативный или регенерирующий эпидермис K6 / K16 / K17. Это выражение обеспечивает удобный способ исследования морфологии и функции в эпидермисе с использованием иммуногистохимии (таблица 15.1).
СТРУКТУРА ДЕРМОЭПИДЕРМАЛЬНОГО СОЕДИНЕНИЯ
Дерма и эпидермис соединяются в дермоэпидермальном соединении (DEJ), которое образует тесную и сложную связь, которая позволяет не только физическое прикрепление эпидермиса к более глубоким структурам, но также и физиологическую связь между двумя компонентами, которая является неотъемлемой частью нормальной функции обоих (рисунок 15.2). DEJ распространяется волнообразно, образуя междометия по всей длине и непрерывно с эпидермальными придатками. Эти взаимосвязи значительно увеличивают площадь контакта, обеспечивая более тесную связь и предотвращая сдвиговые усилия, разделяющие два слоя. DEJ состоит из клеточных мембран тех клеток, которые являются поверхностными для него (то есть кератиноцитов, меланоцитов и клеток Лангерганса), и тех, которые находятся глубоко в нем (фибробласты, тучные клетки и т. Д.), Связанных с общей мембраной - базальной мембраной. DEJ и окружающие комплексы называются зоной базальной мембраны (BMZ).
Базальная поверхность кератиноцитов прикрепляется к lamina lucida через полусухие мосомы. Они состоят в основном из внутренних бляшек на внутренней поверхности клеточной мембраны (обеспечивая непрерывность с тонофиламентами в клетке), наружных бляшек (тесно связанных с самой клеточной мембраной) и суббазальной пластинки, внешней по отношению к клетке и непосредственно прилегающей (и встроен в) в подвальную мембрану. Сама базальная мембрана может быть разделена на три слоя с помощью электронной микроскопии: наружная люцида, промежуточная денс и глубокая фиброзная сетчатка. Внутри lamina lucida имеются многочисленные якорные филаменты, связанные с гемидесмосомами и ориентированные перпендикулярно клеточной и базальной мембранам. Плотная пластинка выглядит относительно аморфной, а фибро-ретикулярный слой, по-видимому, демонстрирует закрепление фибрилл, коротких изогнутых структур, которые простираются в дерму либо по отдельности, либо по отношению к аморфным телам, а затем называются якорными бляшками. В дополнение к приведенному выше электронно-микроскопическому описанию в базальной мембране может быть идентифицирован ряд специфических молекулярных компонентов; они позволяют оценить зрелость путем специфического иммуногистохимического окрашивания (таблица 15.2).
Базальная мембрана присуща стабильности заживления ран. Rigal et al. (1991) определили характер депонирования компонентов базальной мембраны с заживлением в течение 10 дней и показали почти линейное производство большинства компонентов. Первоначально коллаген VII отсутствует, в то время как буллезный пемфигоидный антиген (BPA) и коллаген IV являются преобладающими компонентами. Производство коллагена VII начинается только после 3-го дня, когда BPA, ламинин, фибронектин и коллаген IV присутствуют в значительных количествах. К 7 дню уровни всех этих компонентов относительно равны, и базальная мембрана может быть описана как полностью сформированная.
ЖЖЖЖЖЖЖЖЖ
IN VITRO КЕРАТИНОЦИТНАЯ КУЛЬТУРА
Замена всей кожи зависит от наличия дермы и эпидермиса. Хотя пересадка кожи разделенной толщины удовлетворяет этим критериям, это не всегда возможно, особенно после ожоговой травмы с большой общей площадью ожоговой поверхности. В этом случае возникают две очевидные проблемы. Во-первых, по определению, недостаточно здоровой кожи, чтобы покрыть область ожога, даже с расширением сетки этих трансплантатов. Во-вторых, нанесение дополнительной травмы кожному покрову только усугубляет физиологическую проблему, с которой сталкивается пациент, который может быть уже в критическом состоянии.
В 1975 году Рейнвальд и Грин опубликовали свое случайное открытие, что эпидермальные клетки человека пролиферировали в тех же условиях, что и клетки тератомы мыши (Rheinwald and Green, 1975). В данном случае именно предоставление фидерного слоя фибробластов швейцарской мыши 3T3 и митогенов в культуральной среде, которые позволили быстро пролиферировать человеческим эпителиальным клеткам, стало доказательством одного из самых важных достижений в этой области (рис. 15.3). ,
Методы культивирования кератиноцитов с тех пор были изменены различными способами. Дальнейшая работа (Rheinwald and Green, 1977) оптимизировала условия роста, в результате чего среднее время клеточного цикла составляло 22–24 часа, что намного больше, чем в нормальной или гиперпролиферативной (псориатической) коже. Был внесен ряд незначительных изменений в культуральную среду, что привело к условиям, используемым сегодня (Aasen and Izpisúa Belmonte, 2010). Кератиноциты также могут размножаться в условиях низкого содержания кальция, без фидера и без сыворотки (культура без ксенобиотиков), что благоприятно для удаления загрязняющих клеток, таких как фибробласты, но их пролиферативная продолжительность жизни уменьшается (Aasen and Izpisúa Belmonte, 2010). В оптимальных условиях кусок кожи размером 3 см2 может быть увеличен более чем в 5000 раз в течение 3-4 недель, давая достаточное количество слоев кератиноцитов для покрытия всей поверхности взрослого человека (Atiyeh and Costagliola, 2007).
Есть много факторов, которые влияют на культуру кератиноцитов, наиболее важным из которых является возраст донора. Популяционные удвоения клеток имеют тенденцию уменьшаться с возрастом. Более того, как фибробласты, так и кератиноциты имеют конечное число удвоений популяции, после чего они не подходят для культивирования. Системные заболевания у доноров могут снизить пролиферативную способность кератиноцитов. Кроме того, важен состав клональных типов, т.е. голоклонов, мероклонов или параклонов, полученных из культуры кератиноцитов. Культуры, содержащие больше голоклонов, которые являются стволовыми клетками, обладают наибольшей пролиферативной способностью, и известно, что эти стволовые клетки снижаются с возрастом (Green, 2008).
Внутри культуральной колбы пролиферирующие клетки образуют островки, которые распространяются латерально и, в меньшей степени, расслаиваются; рост происходит преимущественно в горизонтальной плоскости, но дочерние клетки в центре острова начинают расслаиваться. Если вся колба расслаивается, образуется так называемый «зеленый лист», состоящий из 12 слоев клеток. Количество слоев определяется концентрацией ионов кальция в среде; растворы с низким содержанием кальция способствуют образованию монослоя, а растворы с высоким содержанием кальция - из многослойного листа. Лист кератиноцитов, также известный как культивируемый эпителиальный аутотрансплантат (CEA), коммерчески доступен как Epicel и EpiDex, которые используются для лечения частичных и полных ожогов, а также венозных и диабетических язв. Оба этих продукта получены из аутогенных кератиноцитов, хотя EpiDex сделан из кератиноцитов наружной корневой оболочки, полученных из волосяных фолликулов кожи головы (Greaves et al., 2013). Так как CEA очень хрупкий, для сведения к минимуму травм, возникающих при обращении, используются вспомогательные материалы, такие как парафиновая марля или полиуретан. Разнообразные системы доставки были разработаны для облегчения трансплантации и для ограничения любых задержек в экспансии in vitro. В этом случае клетки в основном выращиваются на субстрате и переносятся без необходимости ферментативной диссоциации (Myers et al., 2007; Atiyeh and Costagliola, 2007). Клетки помещают на материал для переноса (например, Laserskin®; Fidia Advanced Biopolymers) in vitro, при этом им не требуется формировать сливной лист - они переносятся, пока еще находятся в отдельных колониях (рис. 15.4). Отсутствие слияния в этом случае выгодно с минимальной стратификацией и, следовательно, дифференциацией. При трансплантации большинство представленных клеток имеют пролиферативный фенотип. Было показано, что этот метод, по меньшей мере, столь же эффективен, как и другие методы, и имеет потенциальные преимущества от уменьшения времени, необходимого для выращивания культуры, или увеличения площади, которая может быть покрыта в данный момент времени (Шевченко и др., 2010) , Другая стратегия заключается в использовании аэрозольного метода для доставки кератиноцитов, когда клетки суспендируют в фибриновом клее и распыляют непосредственно на слой раны. Клетки также собирали с кожи с использованием коммерчески доступного набора ReCell от Avita Medical. Это позволяет немедленно доставлять в рану некультурную смешанную клеточную популяцию, состоящую из кератиноцитов, фибробластов, клеток Лангерганса и меланоцитов (Wood, 2012). Количество меланоцитов быстро уменьшается в культуре и в конечном итоге стабилизируется примерно на 10% от их начальных уровней (Staiano-Coico et al., 1990). Это означает, что конечный продукт, полученный с помощью современных технологий тканевой инженерии, уступает не только в недостатке кожи.
Гистологически культивируемые листовые трансплантаты кератиноцитов состоят из листов клеток с гораздо более простой организацией, чем у нативного эпидермиса. Базальный слой относительно хорошо сформирован, но надбазальные слои имеют неравномерную толщину, состоящую из 2-10 слоев, с плохой организацией. Хотя десмосомы и щелевые соединения присутствуют, клинически кожа чрезвычайно хрупкая.
ИММУНОГЕННОСТЬ И КУЛЬТУРНЫЕ КЕРАТИНОЦИТЫ
Было установлено, что аллотрансплантированные кератиноциты не сохраняются в иммунокомпетентном хозяине (Griffiths et al., 2004). Клетки Лангерганса - эпидермальные дендритные антигенпрезентирующие клетки. Можно уменьшить количество клеток Лангерганса с помощью УФ-облучения in vitro, и это может ослабить реакцию отторжения на аллотрансплантат (Granstein et al., 1987). Клетки Лангерганса плохо размножаются, если они вообще существуют in vitro. Aübock et al. (1988) продемонстрировали длительную, но не неопределенную выживаемость трансплантатов с истощением клеток Лангерганса, а УФ-облучение после трансплантации, по-видимому, продлило выживаемость аллотрансплантата (Granstein et al., 1987). Однако последнее не может повторяться бесконечно, и ожидается, что это отрицательно скажется на заживлении ран. Системные подходы для предотвращения потери аллотрансплантата включали введение циклоспорина А, отдельно или в сочетании с введением антител (Ossevoort et al., 1999), как часть стандартного протокола иммуносупрессии, используемого для трансплантации почки (Wendt et al., 1994), или в виде комбинации ультрафиолетового облучения и 8-метоксипсоралена (Granstein et al., 1987). В конечном счете, однако, появляется мало сомнений в том, что трансплантированные аллогенные кератиноциты теряются из раны (Griffiths et al., 2004).