3 Класса условий и характер труда

1 класс – оптимальные условия и характер труда

2 класс – допустимые условия, при которых уровень опасных и вредных производственных факторов не превышает установленных гигиенических нормативов на рабочих местах

3 класс – вредные и опасные условия и характер труда

3 Степени вредных и опасных условий труда

1 степень – условия и характер труда, вызывающие функциональные нарушения, которые при раннем выявлении и прекращении воздействия носят обратимый характер

2 степень – условия и характер труда, вызывающие стойкие функциональные нарушения, рост заболеваемости с временной утратой трудоспособности

3 степень – условия и характер труда с повышенной опасностью развития профессиональных заболеваний

Обеспечение здоровых и безопасных условий труда

• Соблюдение системы стандартов безопасности труда

• Строгое ведение технологических режимов производства

• Выполнение рекомендаций, разработанных на основе изучения и эксплуатации существующих биотехнологических производств

• Безопасная организация рабочих мест и производства в целом

• Правильное поведение персонала

• Соблюдение общей и личной гигиены

Классы опасности микроорганизмов-продуцентов и готовых продуктов

• 1 класс – чрезвычайно опасные микроорганизмы, обладают выраженным общетоксическим и аллергенным действием

• 2 класс – высокоопасные, могут оказывать сильное аллергенное и общетоксическое действие

• 3 класс – умеренные, обладают слабым общетоксическим и аллергенным действием

• 4 класс – малоопасные, практически не обладают аллергенным и общетоксическим действием

Степень вирулентности LD₅₀ – летальная доза вещества (мг/кг), вызывающая при введении в организм гибель 50% животных

Токсигенность – способность микроорганизмов синтезировать и выделять в окружающую среду токсичные для теплокровных животных экзотоксины

Токсичность – способность микроорганизмов синтезировать токсичные для теплокровных животных эндотоксины, освобождающиеся при лизисе клеток

При комплексной токсико-гигиенической оценке биологической активности штаммов и продуктов их жизнедеятельности определяется:

• Токсичность штаммов (острая, подострая, хроническая)

• Канцерогенные свойства

• Мутагенные свойства

• Тератогенные свойства

• Гонадотоксические свойства

• Эмбриотоксические свойства

• Аллергенные свойства

Показателями опасности непатогенных микроорганизмов является:

• Токсичность

• Токсигенность

• Транзиторное микробоносительство (диссеминация во внутренних органах макроорганизма)

• Иммуногенность

• Дисбиотическое действие

Критерии высокой опасности штамма (1 класс опасности):

• Величина LD₅₀ при введении микроорганизма в желудок мышей менее 10⁷, а при внутрибрюшинном – менее 10⁵ клеток на одно животное

• Выраженная токсичность – величина LD₅₀ при введении убитой нагреванием культуры менее 10⁶ клеток на животное

• Выраженная токсикогенность – величина LD₅₀ при внутрибрюшинном введении фильтрата менее 0.5 мл на животное

Сенсибилизация биологическая — приобретение организмом специфической повышенной чувствительности к чужеродным веществам — аллергенам, повышение его чувствительности к воздействию раздражителей

Иммуномодуляция (иммунокоррекция) -это временное повышение или снижение тех или иных показателей иммунитета

Иммуногенность -это способность антигена вызывать иммунный ответ, а антигенность - это способность антигена связываться с антителом. Иммуногенность - это способность антигена инициировать иммунную систему к формированию эффекторов, нейтрализующих антигенную чужеродность. 

Оценка антигенности м/о – определение иммунных тел м/о в реакциях агглютинации и фагоцитоза нейтрофилами крови

Реакция фагоцитоза – подсчитывается формула крови сенсибилизированных и контрольных животных и определяется доля фагоцитирующих нейтрофилов и индекс активности фагоцитоза (отношение общего числа фагоцитированных клеток микроба и числа фагоцитирующих нейтрофилов)

Оценка иммуномоделирующего эффекта - определение в крови и лимфоидных органах содержания лимфоцитов и их популяций, Т- и В-лимфоцитов.

Пороговая концентрация м/о – вызывает сенсибилизацию 30% животных, увеличение иммунного ответа организма и достоверное изменение неспецифического иммуномодулирующего действия.

Определение дессиминации во внутренних органах

• В конце хронического эксперимента

• Через две недели после его окончания (период восстановления)

Пороговая концентрация – минимальная доза или концентрация, при которой через 2 недели после окончания хронического эксперимента исследуемый м/о высевается из внутренних органов или в них обнаруживаются патоморфологические изменения

Величина ПДК устанавливается исходя из лимитирующего порога хронического действия м/о (иммунотоксического, дисиотического и диссеминации во внутренних органах)

Коэффициент запаса при определении ПДК в воздухе рабочей зоны – 10

Коэффициент запаса при определении ПДК в атмосферном воздухе - 100

История культивирования животных клеток

1 этап – признание идеи о возможности культивирования животных клеток в условиях in vivo

2 этап – культивирование животных клеток как необходимой среды для роста и размножения фильтрующихся вирусов и практическое получение значимых количеств вирусного материала для нужд вирусологии и практической медицины

3 этап – возможность влияния на геном животной клетки, с целью получения гибридных клеток с желаемыми свойствами. Возникновение гибридомной технологии и метода получения моноклональных антител

Подходы и методы:

1. Методики получения клеток, свободных от экзогенных прокариотов и грибов.

2. Методики  разработки среды, в которых рост «вырезанных из ткани» или изолированных клеток не подавляется.

3. Методики наблюдения за клетками в динамике их развития.

4. Методики непрерывного культивирования культур клеток животных in vitro и поддержания их свободными от других биологических агентов.

Основная концепцией, теория Клода Бернара

• Клетка вне организма животного будет стремиться поддерживать свой внутренний гомеостаз, наряду с живым организмом

• Клетка вне организма способна к росту и делению, в случае сходства условий ее существования внутри и вне организма

• Существует реальная возможность обеспечения животной клетки условиями для ее жизнедеятельности, максимально приближенных к условиям in vivo

Основные открытия в технологии клеточных культур

• Использование антибиотиков, которые ингибируют рост контаминантов

• Использование трипсина для высвобождения клеток из тканевой матрицы

• Использование сред с определенным химическим составом.

Использование культуры клеток

• Модельные системы для исследования основ клеточной биологии, взаимодействия между клетками и агентами, вызывающими заболевание, влияние лекарственных препаратов на клетки, процессов и запуска процессов старения, исследований питания

• Тесты на токсичность

Исследование новых лекарственных средств, косметических средств, детергентов и т.д.

• Онкологические исследования

исследование функции различных химических веществ, вирусов и радиации на превращение культивируемых клеток в раковые клетки

• Вирусология

культивирование вирусов, также используется для изучения их инфекционного цикла.

• Генетическая инженерия

производство коммерческих белков, крупномасштабное производство вирусов для выпуска вакцин

• Генная терапия

Клетки, обладающие функциональным геном, могут быть заменены клетками, обладающими нефункциональным геном

• Иммунология - гибридомная технология: клетки, синтезирующие интересующие ученых антитела, подвергают процедуре слияния с клетками миеломы. Полученные гибридомы позволили наладить производство моноклональных антител

• Биотехнология - культуры клеток используются в биотехнологии как источник различных секретируемых веществ: гормонов, интерферона и т. д.

• Эмбриология, развитие и дифференцировка клеток - использование клеточной культуры позволяет изучать дифференцировку клеток in vitro. Поиск корреляции между внешним стимулом на клеточную культуру и морфобиохимическим ответом клеток.

Преимущества метода клеточных культур:

1. Прижизненное наблюдение за клетками, их морфологическими и биохимическими особенностями различными методами, в том числе с использованием световой микроскопии.

2. Возможность оценки состояния клетки «прижизненно», а не «post faсtum», как в случае с опытами на животных.

3. Возможность изменения условий культивирования, что дает широкие возможности в оценке факторов, влияющих на клеточный метаболизм.

4. Оценка и получение результатов, при использованием небольшого количества клеточного материала, что снимает проблему использования большого количества животных.

5. Использование клеточной культуры снимает множество этических проблем, связанных как с использованием большого количества клинического материала, так и при тестировании потенциально опасных и токсических веществ.

6. Клеточная культура доступна для различных биохимических манипуляций, в том числе с ядами, гормонами, токсинами, радиоактивными соединениями и т.д.

7. При использовании клеточной культуры оценивается прямое воздействие исследуемого вещества, без опасения, что оно будет метаболизировано печенью или почками.

8. Становится возможным рассчитать точную концентрацию тестируемого вещества, вызываемого тот или иной эффект.

Животные клетки гораздо сложнее культивировать in vitro

1. Требуются более сложные по составу питательные среды.

2. Клетки очень чувствительны к механическим воздействиям.

3. Рост клеток происходит преимущественно после прикрепления к поверхности.

4. Культуры имеют низкую скорость роста.

Типы животных клеток, которые культивируют in vitro:

соединительной ткани – фибробласты; скелетной – кость и хрящи;

мышечной – скелетные, сердечные и гладкие мышцы;

эпителиальной – печень, легкие, кожа, мочевой пузырь, почки, молочная железа;

нервной – глиальные клетки и нейроны (хотя они лишены способности к пролиферации);

эндокринной системы – гипофиз, надпочечники, клетки островков Лангерганса;

различные типы опухолевых клеток.

• По продолжительности культивирования in vitro (первичные культуры, диплоидные культуры, постоянные культуры)

• По способу культивирования (монослойные, суспензионные, на микроносителях и т. п.).

Первичные культуры

• Получают путем диспергирования тканей разными методами, выделяя клетки с помощью ферментов

• Клетки выращивают в течение 1-3 пассажей (производство вакцин, тестирование препаратов, типирование вирусов)

диплоидные культуры, чаще получаемые из эмбриональных тканей и сохраняющие диплоидный набор хромосом до 50 пересевов (для производства вакцин, получения диагностических препаратов)

Преимущества диплоидных клеточных линий по сравнению с первичными культурами :

•однородность популяции;

•стабильность морфологических свойств;

• высокая чувствительность к вирусам;

•возможность масштабирования и хранения в жидком азоте

Перевиваемая культура клеток – при длительном культивировании приобретают способность к размножению вне организма неопределенно долгое время – линии клеток

Ограниченная линия клеток – линия клеток, гибнущая после нескольких пересевов

Постоянная (перевиваемая) линия клеток – после нескольких пересевов получается однородная популяция клеток, может существовать вне организма десятки лет

Образование постоянной клеточной культуры отражается на комплексе морфофизиологических особенностях клеток:

• уменьшение размера клеток,

• снижение их адгезивности,

• округление,

• увеличение ядерно-цитоплазматического соотношения,

• увеличение скорости роста (время генерации клеток),

• по снижению зависимости от сыворотки и возможности поддержания в более простых средах,

• снижение зависимости от субстрата и, следовательно, их способность к росту в суспензии;

• увеличение гетероплоидности (хромосомные различия между клетками) и анеуплоидности (изменяется количество хромосом )

• увеличение опухолеродности

Преимущества постоянных клеточных линий

• высокая скорость роста,

• возможность достижения более высокой плотности и, следовательно, более высокого выхода биомассы;

• возможность использования более дешевых сред;

• способность к суспензионному росту

Недостатки постоянных клеточных линий

• повышенная хромосомная нестабильность,

• отклонение от фенотипа донора,

• утрата специфических маркеров

Особенности в биологии культивируемых клеток in vitro заключается в следующем:

1. Клетки животных и, в особенности, млекопитающих способны расти в состоянии клеточной культуры лишь прикрепленными к какому-либо субстрату. В качестве субстрата можно использовать другие клетки, коллаген, желатин (денатурированный коллаген), стекло или пластик. В случае отделения культуральных клеток от субстрата, происходит остановка роста и размножения, быстрая дегенерация такой суспензионной культуры.

2. Клетки растущей клеточной культуры находятся в клеточном цикле деления и делятся с периодичностью примерно 1 раз в 24 часа.

3. Клеточные культуры находятся под контролем своего роста, что связано с постоянным действием лимитирующих факторов.

4. Поддержание постоянной плотности популяции клеточной культуры в результате согласования скорости деления.

5. Клетки, делящиеся в культуре, претерпевают в процессе своего роста так называемое контактное торможение. При достижении клетками плотного монослоя, при котором клетки плотно прилегают друг к другу, происходит остановка деления клеток. При контакте клетки с соседней клеткой происходит прекращение движения в этом направлении, так называемое контактное ингибирование. При достижении монослойности, клетки культуры прекращают свое движение.

Проблемы культивирования клеток

• Повышение эффективности использования компонентов питательной среды и увеличения продуктивности клеток

• Переход к суспензионному культивированию

Создание коллекций культур клеток

Американская коллекция типовых культур (Вашингтон)

Европейская коллекция культур (Великобритания)

Более 800 линий клеток или 450 линий и клонов клеток 43 видов животных, включая 200 штаммов фибробластов человека, 2 линии комаров

Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского (Москва)НИИ цитологии РАН (Санкт-Петербург)

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (Новосибирск)

НИИ ветеринарии РАСХН (Москва)

Паспортизация культур клеток

• Полное наименование

• Тканевое и видовое происхождение

• Описание культуральных и морфологических свойств культуры

• Описание кариотипа, особенностей криоконсервации

• Данные по контролю контаминации клеток посторонними микроорганизмами

• Подтверждение видовой идентичности и данные по чувствительности клеток к вирусам или их продуктивности в случае использования культур клеток в качестве продуцентов рекомбинантных препаратов

Контроль контаминации культуры клеток микроорганизмами

• бактериями

• Грибами

• Вирусами (реакция гемадсорбции с эритроцитами 0 группы человека или морской свинки, пассирование на чувствительных клетках, электронная микроскопия и т.д.

• Микоплазмами (от 10-15 до 45-90%)

Наличие микоплазм

• Индуцировать хромосомные абберации

• Влияют на синтез белков, нуклеиновых кислот, клеточных мембран, ангиогенез, индукцию туморогенных потенций, дегенеративных изменений (цитопатический эффект), гибель клеток

Деконтаминация

• Антибиотики

• Химические реагенты

• Физические методы (нагревание до ну е41 С)

• Частотно-резонансный метод

Источники заражения

• Нестерильность рабочего помещения

• Первичный материал

• Инфицированная сыворотка

• Люди

• Окружающая среда