1 курс 1 семестр / Химия / medchem_SAM_med_rus

ХРОМАТОГРАФИЯ. КЛАССИФИКАЦИЯ МЕТОДОВ. ИСПОЛЬЗОВАНИЙ В МЕДИЦИНСКОМ АНАЛИЗЕ.

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ:

Хроматография – один из методов количественного и качественного анализа. Она сыграла важную роль в развитии биологической и медицинской наук, так как методы хроматографического анализа были использованы для разделения и очистки белков, аминокислот, пуринових и пиримидиновых оснований, углеводов и других биологически активних веществ.

В настоящее время хроматографические методы анализа так же находять широкое применение в медико-биологических исследованиях и в клинической практике, в первую очередь с целью диагностики. С помощью этого метода можно выявлять в биологических жидкостях различные микроэлементы, появляющиеся в случае той или иной патологии. Применение хроматографии позволяет осуществлять быструю диагностику при острах химических отравлениях и контролировать процесс детоксикации организма. Этот метод анализа дает возможность практически мгновенно определять содержание в крови алкоголя, наркотиков, летучих веществ, вызывающих токсикоманию. Хроматография используется также и для допинг-контроля с целью обнаружения стимулирующих веществ в организме спортсменов. Особенно велика роль хроматографии в диагностике врожденных и приобретенных нарушений метаболизма – таких заболеваний, как сахарный диабет, подагра и т.п.

Хроматографический анализ карбонових кислот, принимающих участие в цикле Кребса и отвечающих за энергетическое обеспечение клеток, помог понять глубже процессы внутриклеточного метаболизма при разных патологических состояниях. Хроматографические исследования состава липидов крови способствовали установлению причин возникновения и лечения атеросклероза, помогли понять процессы внутриклеточного метаболизма. Результаты хроматографического анализа дают важную информацию о состоянии здоровья человека, течении болезни, эффективности применения тех или иных лекарственных препаратов.

Таким образом, хроматография является ценным методом клинического

ЦЕЛИ ОБУЧЕНИЯ:

ОБЩАЯ ЦЕЛЬ:

Уметь идентифицировать различные методы хроматографического анализа и применять их на практике.

49

КОНКРЕТНЫЕ ЦЕЛИ:

УМЕТЬ:

1.Идентифицировать различные виды хроматографического анализа в зависимости от физико-химического механизма разделения и техники выполнения.

2.Интерпретировать адсорбционную, ионообменную и распределительную хроматографию как важнейшие методы аналитической и препаративной хроматографии.

3.Трактовать различные виды хроматограмм.

4.Интерпретировать значение хроматографических методов анализа в медицинской и фармацевтической практике.

СОДЕРЖАНИЕ ОБУЧЕНИЯ

1. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ:

1.Сущность хроматографического метода анализа.

2.Классификация методов хроматографии:

−по агрегатному состоянию подвижной фазы;

−по механизму процесса разделения смеси компонентов;

−по технике выполнения анализа.

3.Адсорбционная хроматография.

4.Ионообменная хроматография. Аниониты и катиониты.

5.Распределительная хроматография. Закон Нернста. Коэффициент распределения. Бумажная и колоночная хроматография.

6.Применение хроматографического метода анализа в биологии, фармации и клинической медицине.

2. ОСНОВНЫЕ ТЕРМИНЫ И ИХ ОПРЕДЕЛЕНИЯ:

Хроматография – физико-химический метод анализа и разделения смесей веществ, основанный на их различном распределении между двумя фазами, одна из которых неподвижная (твердое тело или жидкость), а другая – подвижная (газ или жидкость), которая при этом фильтруется через неподвижную.

Благодаря техническому прогрессу хроматография стала универсальным методом анализа (аналитическая хроматография) и разделения

(препаративная хроматография) смесей любих веществ и – что самое главное

– веществ, очень близких по строению и свойствам.

Хроматографические методы подразделяются по таким признакам:

–по агрегатному состоянию подвижной фазы: газовая, газово-жидкостная

ижидкостная хроматография;

–по механизму разделения: адсорбционная, ионообменная, распределительная, осадочная, аффинная хроматография;

50

– по технике выполнения анализа: колоночная, капилярная, тонкослойная, бумажная хроматография.

Разделение компонентов смеси может происходить по различным признакам:

коэффициентам адсорбции, распределения, растворимости, по способности

парообразную смесь веществ, подлежащую анализу. Неподвижной фазой

определенным давленим. Двигаясь через колонку, компоненты смеси поразному распределяются между обеими фазами.

Если же неподвижной фазой является не жидкость, а твердый адсорбент (силикагель, оксид алюминия), то такой вариант газовой хроматографии называют газоадсорбционной хроматографией.

В жидкостной хроматографии подвижной фазой служит жидкость, а неподвижной – жидкость или твердое тело. Среди разновидностей жидкостной хроматографии особого внимания в плане применения в медикобиологической практике заслуживает метод высокоэффективной жидкостной хроматографи (ВЭЖХ), в котором подвижной фазой является специально подобранная смесь растворителей.

Сущность адсорбционной хроматографии состоит в разделении смесей веществ, основанном на их различной способности к адсорбции на том или другом адсорбенте (неподвижной фазе).

Ионообменная хроматография основана на различной способности ионов, входящих в анализируемую смесь, обмениваться с ионами, входящими в состав ионообменника (неподвижная фаза).

В основу аффинной (биоспецифической) хроматографии положено свойство некоторых соединений «узнавать» в смеси лишь «свои» вещества и взаимодействовать с ними.

Осадочная хроматография основана на различии в растворимости осадков, которые образуются в результате химического взаимодействия компонентов смеси с веществом неподвижной фазы.

51

Воснову распределительной хроматографии положено свойство веществ распределяться между неподвижной фазой (жидкость) и подвижной (газ или

жидкость) в соответствии с их коэффициентами распределения Rf. Теоретической основой распределительной хроматографии служит закон

распределения Нернста, согласно котрому при постоянной температуре соотношение концентраций веществ, распределяющихся между двумя жидкостями, не смешивающимися между собой, является величиной постоянной.

Неподвижная фаза может бать зафиксирована на хроматографической бумаге (бумажная хроматография), на тонком слое адсобента (тонкослойная хроматография) или диспергирована в объеме твердого носителя (колоночная хроматография).

Вварианте бумажной хроматографии для определения коэффициента

распределения Rf прежде всего измеряют расстояние l от линии старта (место нанесения вещества на бумагу) к центру пятна на хроматограмме, которое соответствует этому веществу. Измеряют также расстояние L от линии старта до линии финиша ( фронт растворителя). Отношение пути, пройденного веществом, к пути, пройденному растворителем, и будет коэффициентом распределения Rf данного вещества между подвижной и неподвижной фазами.

Вметоде тонкослойной хроматографии роль носителя выполняет слой порошкообразного сорбента, нанесенный на стеклянную или металлическую пластинку. В качестве сорбентов применяют силикагель, алюминий оксид, магний силикат. Анализ этим методом в целом мало чем отличается от бумажной хроматографии, но в тоже время он имеет ряд преимуществ: высокая

скорость процесса хроматографирования, применение в качестве неподвижной фазы большого ассортимента сорбентов, использование кислых и щелочных подвижных фаз и обработка хроматограмм при повышенных температурах.

В методе капиллярной хроматографии разделение компонентов смеси происходит в капиллярах длиной 30 – 90 м ( а найлоновые капилляры могут иметь длину до 1600 м ). Жидкая неподвижная фаза наносится прямо на внутренние стенки капилляра (без твердого адсорбента-носителя), т.е. стенки капилляра смачиваются необходимой жидкостью.

52

3. ГРАФ ЛОГИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ ТЕМЫ

ХРОМАТОГРАФИЯ

Классификация

Применение хроматографических методов анализа в биологии, медицине и фармации

53

4. ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ: Основная литература:

1.Мороз А.С., Луцевич Д.Д., Яворська Л.П. Медична хімія. – Вінниця:

Нова книга, 2006. – С. 594-602.

2.Медицинская химия: учебник. Калибабчук В.А., Грищенко Л.И., Галинская В.И. и др. – К.: Медицина, 2008. – С. 244-251.

Дополнительная литература:

3.Биофизическая химия. Л.П. Садовничая, В.Г. Хухрянский, А.Я. Цыганенко. – К.: Вища шк. Головное изд-во, 1986. – С. 183-186.

4.Равич-Щербо М.И., Новиков В.В. Физическая и коллоидная химия. Учебник для ин-тов. – М.: Высш. школа, 1975. – С. 168-174.

ОРИЕНТИРОВАННАЯ ОСНОВА ДЕЯТЕЛЬНОСТИ

НАБОР ОБУЧАЮЩИХ ЗАДАЧ Задача 1.

Укажите, как различают хроматографические методы анализа по технике выполнения.

Эталон ответа:

Задача 2.

Как различают хроматографические методы по признакам: 1) агрегатного состояния подвижной и неподвижной фаз; 2) механизма процесса разделения смесей компонентов?

54

Задача 3.

Студент на лабораторно-практическом занятии проводил разделение смеси катионов Cu+2 и Fe+3 методом бумажной адсорбционной хроматографии. При этом ему было необходимо рассчитать коэффициент распределения для каждого из веществ. На полученной хроматограмме он измерил расстояние от стартовой линии хроматограммы до линии фронта растворителя. Оно было равно 5,8 см. Расстояния от линии старта до центров пятен Cu+2 и Fe+3 были соответственно равны 2,6 и 3,7 см.

Эталон решения.

Для определения коэффициента распределения измеряют расстояние l от линии старта (место нанесения вещества на бумагу) к центру пятна на хроматограмме, которое соответствует этому веществу. Измеряют также расстояние L от линии старта до линии финиша (фронт растворителя). Отношение пути пройденного веществом, к пути, пройденному растворителем, и будет коэффициентом распределения Rf данного вещества между подвижной и неподвижной фазами. Следовательно Rf служит качественной характеристикой вещества. Сравнение полученных экспериментальным путем коэффициентов распределения со справочными дает возможность идентифицировать вещества, входящие в состав смеси.

Таким образом,

Rf (Cu2+)= l(Cu2+) : Lраствор. = 2,6:5,8 = 0,45 Rf (Fe3+)= l(Fe3+) : Lраствор.= 3,7:5,8 = 0,64

Задача 4.

Для какой из аминокислот – цистеина или тирозина – скорость перемещения на бумаге в смеси вода – фенол будет больше, если известно , что Rf для этих кислот равен соответственно 0,19 и 0,52?

Задача 5.

Соединение А прошло lА=8,6 см от линии старта на хроматогрфичесой плстине. Растворитель за это время прошел расстояние 17,8 см. Рассчитайте Rf соединения А.

Эталон решения.

Rf= lА: Lраствор.=8,6:17,8 = 0,48

Задача 6.

Смесь двух веществ проанализировали методом тонкослойной хроматографии. Анализ хроматограммы показал, что расстояние от линии старта до центров пятен составляют: lb1= 4,5 см и lb2= 7,5 см. Растворитель прошел расстояние 12,5 см. Рассчитайте величины Rf .

Задача 7.

Для стандартных растворов веществ А и В были получены следующие значения Rf соответственно 0,56 и 0,34. При хроматографоровании в тех же условиях неизвестного раствора на пластинке были получены два пятна,

55

расположенные на расстоянии 5,7 см и 4,3 см. Растворитель же прошел расстояние, равное 12,6 см. Установите, присутствуют ли в анализруемом растворе вещества А и В.

Эталон решения.

Рассчитаем значение Rf для неизвестных веществ в анализируемом растворе:

Rf(1)=5,7:12 ,6 = 4,5

Rf(2)=4,3:12 ,6 = 0,34

Следовательно, в анализируемом растворе находиться вещество В.

Задача 8.

При хроматографировании растворов фенобарбитала и бутадиона были получены расстояния от стартовой линии к центру пятна 5,1 см и 6,1 см соответственно; а расстояние от стартовой линии к линии фронта растворителя

Задача 9.

При хроматографировании растворов глюкозы и лактозы были получены соответствующие расстояния от стартовой линии к центру пятна 4,6 см и 2,3 см соответственно; а расстояние от стартовой линии к линии фронта растворителя 10 см. Установите Rf для каждого из сахаров. Определите, для какого из углеводов – глюкозы или лактозы – скорость перемещения на бумаге в системе растворителей С2 ( таблица 1) будет больше.

Эталон решения.

Рассчитаем значение Rf для глюкозы в анализируемом растворе:

Rf (глюкози)= l(глюк.): Lраствор = 4,6:10 = 0,46

Рассчитаем значение Rf для лактозы в анализируемом растворе:

Rf (лактози)= l(лакт.): Lрозчин. = 2,3:10 = 0,23

Исходя из полученных значений Rf для сахаров мы можем сделать вывод, что скорость перемещения в данной системе растворителей у глюкозы будет больше.

Задача 10.

При хроматографировании растворов фруктозы и сахарозы были получены расстояния от стартовой линии к центру пятна каждый из них: 6,0 см и 4,3 см соответственно; а расстояние от стартовой линии к линии фронта растворителя 12 см. Установите Rf для каждого из сахаров.

(Эталон ответа: Rf фруктозы = 0,50; Rf сахарозы = 0,36).

56

катионов не может быть идентифицирован в смеси? – а) Zn2+,Co2+ , Al3+ ; б) Cd2+, Zn2+ ,Co2+; в)Co2+ ,Bi3+ , Al3+.

(Эталон ответа: а)Co2+ , Al3+ ; б) Cd2+, Zn2+ ; в)Co2+ ,Al3+).

Задача 12.

Методом тонкослойной хроматографии проведено разделение смеси двух органических соединеий А и В. Использована система растворителей метилэтилкетонуксусная кислота-метанол. Получены следующие результаты: расстояние до центра первого пятна lА= 3,9 см, а расстояние до центра второго пятна lВ= 6,1 см, растворитель прошел расстояние Lраств = 15,6 см. Рассчитайте величины Rf .

Эталон решения.

Rf(А)=3,9:15,6 = 0,25

Rf(В)=6,1:15,6 = 0,39

Задача 13.

В состав анализируемой смеси входять три органических соединения. Анализ тонкослойной хроматограммы показал, что расстояния от линии старта до центров пятен равны соответственно: lb1= 3,3 см, lb2= 7,2 см, lb3= 8,6 см. Растворитель прошел расстояние Lраств = 14,3 см. Рассчитайте величины Rf .

Задача 14.

Для разделения веществ методом тонкослойной хроматографии необходимо, чтобы соответствующие им пятна находились друг от друга на расстоянии не менее 1 см. Пусть по условиям эксперимента путь, пройденный растворителем, не может бать больше 14 см. Пользуясь таблицей №1, выберите систему растворителей для разделения фруктозы и сахарозы.

Таблица №1

Значения Rf сахаров

С1 – метилэтилкетон – уксусная кислота – метанол (1:1:3); С2 – бутанол – этилацетат – пропанол-2 – уксусная кислота – вода

( 35:100:60:35:30).

Эталон решения.

Коэффициент распределения Rf данного вещества между подвижной и неподвижной фазами – это отношение пути пройденного веществом, к пути, пройденному растворителем. Зная Rf и расстояние, пройденное растворителем

57

воспользуемся формулой Rf= lвещества : Lрастворителя для расчета расстояния, пройденного веществом:

а) для системы растворителей С1

lфруктозы = Rf · Lрастворителя = 0,31 · 14 = 4,34 см; lсахарозы = Rf · Lрастворителя = 0,29 · 14 = 4,06 см.

б) для системы растворителей С2

lфруктозы = Rf · Lрастворителя = 0,50 · 14 = 7,00 см; lсахарозы = Rf · Lрастворителя = 0,36 · 14 = 5,02 см.

По условию задачи для разделения веществ необходимо, чтобы соответствующие им пятна находились друг от друга на расстоянии не менее 1 см. Следовательно, условие задачи выполняется при использовании в данном методе системы растворителей С2.

Задача 15.

Для идентификации органического соединения получены две тонкослойные хроматограммы в разных системах растворителей С1 и С2; С1− метилэтилкетон– уксусная кислота – метанол (1:1:3); С2 – бутанол–этилацетат–пропанол-2– уксусная кислота – вода (35:100:60:35:30). Получены следующие результаты: Lраств – расстояние, пройденное растворителем; lb – расстояние от линии старта

до центра пятна. Система С1: Lраств = 14,3см, lb = 4,6см. Система С2: Lраств =14,8см, lb =8,9 см. Рассчитайте величины Rf .

НАБОР ЗАДАНИЙ ДЛЯ ПРОВЕРКИ ДОСТИЖЕНИЯ КОНКРЕТНЫХ ЦЕЛЕЙ ОБУЧЕНИЯ

Задание 1.

Фармацевт разделил смесь веществ на фракции методом, основанном на распределении компонентов смеси между неподвижной и подвижной фазами. Укажите название данного метода:

A.Электрофорез;

B.Электроосмос;

C.Компенсационный диализ;

D.Хроматография;

E.Нефелометрия.

Задание 2.

Среди большого количества химических и физико-химических методов разделения, анализа, исследования структур и свойств веществ и их смесей одно из ведущих мест занимает хроматография. Укажите явление, которое лежит в основе этого метода анализа:

A.Диализ;

B.Адсорбция;

C.Осмос;

D.Абсорбция;

E.Опалесценсия.

58