Тесты с ответами
.pdf2)изометрические вирусы с кубической симметрией;
3)вирусы с бинарной симметрией, например фаги: у них головка имеет кубический тип симметрии, а хвостик — спиральный;
4)более сложно организованные вирусы, имеющие вторую оболочку.
Оболочка, в которую упакована геномная нуклеиновая кислота, называется капсидом. Наиболее просто организованные вирусы представляют собой нуклеокапсиды: они состоят только из нуклеиновой кислоты и белковой оболочки, построенной из идентичных пептидных молекул. Поскольку число ами нокислотных остатков в белковой молекуле всегда меньше числа нуклеотидов в гене (код триплетный), то для того, чтобы упаковать геномную нуклеиновую кислоту, требуется большое число одинаковых белковых молекул. А многократное повторение белокбелковых взаимодействий возможно лишь при условии симметричного расположения субъединиц. Существует всего два способа упаковки одинаковых белковых молекул в капсид, при которых он обладал бы стабильностью. Полимер будет стабильным, если он соответствует наименьшему уровню свободной энергии. Процесс образования такого полимера родствен процессу кристаллизации, он протекает по типу самосборки. Один из вариантов такой самосборки происходит с использованием спиральной симметрии, другой — кубической симметрии.
При спиральной симметрии (ее имеют нитевидные вирусы) белковые субъединицы располагаются по спирали, а между ними, также по спирали, уложена геномная нуклеиновая кислота.
При спиральной симметрии белковый чехол лучше защищает геномную нуклеиновую кислоту, но при этом требуется большее количество белка, чем при кубической симметрии. Большинство вирусов с замкнутым чехлом обладает кубической симметрией. В ее основе лежат различные комбинации равносторонних треугольников, образующихся из сочетания шаровидных белковых субъединиц. Сочетаясь определенным образом друг с другом, они могут формировать замкнутую сферическую поверхность. Из различных сочетаний равносторонних треугольников, которые образуют общую вершину и общую ось симметрии, могут возникать различные варианты многогранников: тетраэдры, октаэдры и икосаэдры.
Типы взаимодействия вируса с клеткой. Различают три типа взаимодействия вируса с клеткой: продуктивный, абортивный и ин-тегративный.
Продуктивный тип — завершается образованием нового поколения вирионов и гибелью (лизисом) зараженных клеток (цитоли-тическая форма). Некоторые вирусы выходят из клеток, не разрушая их (нецитолитическая форма).
Абортивный тип — не завершается образованием новых вирионов, поскольку инфекционный процесс в клетке прерывается на одном из этапов.
Интегративный тип, или вирогения — характеризуется встраиванием (интеграцией) вирусной ДНК в виде провируса в хромосому клетки и их совместным сосуществованием (совместная репликация).
Основные этапы взаимодействия вируса с клеткой:
1)адсорбция вируса на клетке;
2)проникновение вируса в клетку;
3)«раздевание» вируса;
4)биосинтез вирусных компонентов в клетке;
5)формирование вирусов; выход вирусов из клетки.
3. Вирусы, их природа, происхождение. Методы культивирования вирусов.
Вирусы — мельчайшие микробы, не имеющие клеточного строения, белоксинтезирующей системы, содержащие только ДНК или РНК. Относятся к царству Vira. Являясь облигатными внутриклеточными паразитами, вирусы размножаются в цитоплазме или ядре клетки. Они — автономные генетические структуры. Отличаются особым — разобщенным (дисъюнктивным) способом размножения (репродукции): в клетке отдельно синтезируются нуклеиновые кислоты
вирусов и их белки, затем происходит их сборка в вирусные частицы. Сформированная вирусная частица называется вирионом.
Методы культивирования вирусов
Поскольку вирусы не растут на искусственных питательных средах, а размножаются только внутриклеточно, нужно было найти простые и общедоступные методы их культивирования. Крупным достижением было предложение Р. Гудпасчура в 1932 г. использовать для культивирования вирусов куриные эмбрионы, в клетках которых успешно размножаются многие вирусы. Однако окончательное решение проблемы их культивирования оказалось возможным лишь после того, как были разработаны основные способы культивирования клеток вне организма.
Хотя способность клеток расти вне организма была установлена еще в 1907 г., потребовалось много лет для разработки доступных методов культивирования клеток, а в них — вирусов. Вначале был использован метод переживающих тканей. Он заключался в том, что в колбу, содержащую питательную среду, вносили кусочек ткани. Клетки некоторых тканей в таких условиях могут переживать (но не размножаться) до 30 дней, а в них могут размножаться вирусы. Однако этот способ давал очень небольшой выход вирусов. Необходимо было разработать усло - вия, при которых клетки ткани могли бы свободно размножаться. К началу второй половины XX в. эпидемии полиомиелита приняли настолько широкий и опасный характер, что требовалось принять немедленные меры для создания вакцины, которую можно было бы использовать для массового применения. Но для этого нужно было найти метод, позволяющий быстро выращивать вирусы в большом количестве. Это и явилось одним из обстоятельств, стимулировавших разработку методов культивирования вирусов. Для получения культур клеток, которые можно было бы использовать для выращивания вирусов, необходимо было решить четыре главных проблемы:
1)получить в необходимом количестве свободные (т. е. изолированные друг от друга) клетки;
2)создать такие питательные среды и условия, в которых клетки могли бы активно размножаться;
3)обеспечить условия, при которых в культурах клеток не могли бы размножаться бактерии;
4) определить методы, с помощью которых можно было бы распознавать рост вируса в культуре клеток и идентифицировать его.
Все эти проблемы были решены. Для выделения изолированных, но жизнеспособных клеток из разрушенных тканей использовали обработку их слабым раствором трипсина, разрушающего межклеточные мостики. Для культивирования клеток были предложены различные среды, содержащие все необходимые для размножения клеток питательные вещества (аминокислоты, основания, витамины и др.), минеральные соли, имеющие оптимальную рН и т. д. К питательным средам добавляли индикатор, по изменению цвета которого можно было судить о метаболизме клеток и их размножении. Было установлено, что в качестве основы, на которой клетки размножаются и образуют монослой, может быть использовано хорошо обработанное стекло пробирок и колб. Для подавления возможного роста бактерий вируссодержащий материал перед посевом его в культуры клеток обрабатывают антибиотиками. Решающее значение имели опыты, проведенные в 1949 г. Дж. Эндерсом, Т. Веллером и Ф. Роббинсом, которые показали, что вирус полиомиелита хорошо размножается в первично-трипсинизированных культурах клеток, полученных из почек обезьян.
Разработка способов получения культур клеток позволила широко внедрить в практическую медицину современные классические методы вирусологической диагностики инфекционных заболеваний, с одной стороны, и обеспечить накопление вирусов в количествах, достаточных для производства вакцин, с другой. Основной недостат ок первично-трипсинизированных клеток заключается в том, что после нескольких пересевов они перестают размножаться. Поэтому предпочтением стали пользоваться культуры таких клеток, которые способны размножаться in vitro бесконечно долго. Такие перевиваемые культуры клеток получают из опухолевых тканей (НеLа, НЕр-2 и др.) или из мутантных клеток с полиплоидным набором хромосом. Однако опухолевые клетки нельзя применять для получения вакцин. Для этих целей используют только культуры таких клеток, которые не содержат никаких контаминантных вирусов и не обладают злокачественностью. Лучше всего этим требованиям отвечают культуры диплоидных клеток. «Штаммом диплоидных клеток называется морфологигески однородная культура клеток, стабилизированная в процессе культивирования in vitro, имеющая огранигенный срок жизни, характеризующаяся тремя фазами роста (стабилизации, активного роста и старения), сохраняющая в процессе пассирования кариотип, свойственный исходной ткани, свободная от контаминантов и не обладающая онкогенной активностью при трансплантации хомячкам» (решение Симпозиума по диплоидным клеткам, Москва, 1971).
Как оказалось, вирусы могут размножаться не только в культурах клеток, образующих монослой на стекле пробирок, но и в суспензиях живых клеток.
Таким образом, для выделения чистых культур вирусов в настоящее время используют чаще всего заражение куриных эмбрионов, первично-трипсинизированных и перевиваемых культур клеток.
Широкое распространение получил предложенный в 1952 г. Р. Дюльбекко метод бляшек (негативных колоний), позволяющий производить количественное определение вирусов. Для выделения вирусов монослой клеток после удаления питательной среды заражают вируссодержащим материалом и покрывают слоем агара, содержащего
индикатор нейтральный красный. Чашки (флаконы) инкубируют при температуре 37 °С. Через 48—96 ч выявляются пятна-бляшки. Они имеют диаметр 1—3 мм и выглядят неокрашенными на розовом фоне. Пятна возникают за счет цитопатического действия вируса. Этот метод позволяет непосредственно обнаруживать рост вирусов.
Различают два механизма гибели клеток, вызываемой вирусами, — некроз и апоптоз. Некроз происходит из-за необратимых нарушений целостности клеточных мембран, апоптоз — вследствие фрагментации ядерной ДНК под действием клеточной эндонуклеазы. Установлено, что апоптоз играет важную роль в патогенезе инфекций, вызываемых рядом РНК-содержащих вирусов (ретровирусов, миксовирусов, альфавирусов, буньявирусов, пикорнавирусов, флавивирусов).
Цитопатическое действие вирусов может проявляться в виде следующих изменений:
1)Равномерная мелкозернистая деструкция клеток (полиовирусы, вирусы Коксаки и др.).
2)Очаговая мелкозернистая дегенерация клеток (вирус гриппа, клещевого энцефалита и др.).
3)Гроздевидная дегенерация клеток (аденовирусы).
4)Крупнозернистая равномерная деструкция клеток (вирус герпеса).
5)Симпластообразование (респираторно-синцитиальный вирус, вирус кори и другие).
Оросте вирусов в клетках можно судить также по поведению индикатора, добавляемого к питательной среде. Если клетки активно осуществляют метаболизм, рН среды сдвигается в кислую сторону, и среда окрашивается в желтый цвет. В случае размножения вируса клетки погибают, рН среды мало меняется, и она сохраняет первоначальный
(малиновый) цвет или (при нейтральной рН) приобретает оранжевый. Некоторые вирусы, в частности вирус гриппа, обладают особыми рецепторами (гемагглютининами), с помощью которых они адсорбируются на эритроцитах и вызывают их склеивание (гемагглютинацию). Такие вирусы легко обнаруживаются с помощью реакции гемагглютинации или гемадсорбции (эритроциты адсорбируются на инфицированных вирусами клетках культуры тканей, см. цв. вкл., рис. 79,1). Кроме того, для обнаружения вируса в культурах клеток могут быть исполь зованы различные серологические реакции: преципитации в агаре, иммунофлуоресценции, РСК, ИФМ и пр., а также метод ДНК-зонда и заражение животных, чувствительных к данному вирусу.
4. Строение бактериофагов. Взаимодействие Т-фагов с микробной клеткой (адсорбция, проникновение фаговой ДНК в клетку, размножение фага и выход его из клетки). Лизогения и лизогенная конверсия, механизм. Практическое использование фагов в медицине.
Бактериофаги— вирусы бактерий. Бактериофагия — процесс взаимодействия фагов с бактериями, заканчивающийся очень часто их разрушением.
Поскольку естественной средой обитания любого фага является микробная клетка, жизнь фагов связана с бактериями. Фагам присущи все биологические особенности, которые свойственны вирусам. Их геном представлен либо ДНК, либо РНК и заключен в белковую оболочку (капсид), структурные субъединицы которой уложены по типу либо спиральной, либо кубической симметрии. Крупные фаги, имеющие хвостик, устроены по типу бинарной симметрии (головка — икосаэдр, хвостик — спиральная симметрия). Фаги различаются по форме — нитевидные, сферические; фаги, имеющие головку и хвостик; по размерам — мелкие, среднего размера и крупные. Чем крупнее фаги, тем больше у них генов и сложнее их жизненный цикл.
Лизогения и лизогенная конверсия, механизм.
Жизненный цикл фага может проявляться в форме продуктивной (фаг размножается в клетке и выходит из нее), редуктивной (геном фага проникает в клетку, однако размножения фага не происходит, его геном интегрируется в хромосому клетки-хозяина, становится ее составной частью, т. е. фаг превращается в профаг, а клетка становится лизогенной) и абортивной инфекции, при которой взаимодействие фага с клет кой обрывается на какой-то стадии жизненного цикла фага, и он погибает.
Клетка, несущая профаг, называется лизогенной, потому что профаг, передающийся клеткой по наследству, может выйти из хромосомы, активироваться и вызватьпродуктивную форму инфекции.
Если в результате лизогении, т. е. внедрения профага в хромосому клетки-хозяина, она получает новые наследуемые признаки, такую форму ее изменчивости называют лизогенной конверсией, т. е. изменчивостью, обусловленной лизогенией. Лизогенную конверсию вызывают только умеренные фаги.
Взаимодействие Т-фагов с микробной клеткой:
1)Адсорбция фагов на клеточной поверхности бактерий при помощи специфических рецепторов (белков-лоцманов), которые располагаются на кончике нити, шипа или хвостика. В свою очередь, на клеточной стенке бактерии располагаются ее фагоспецифические рецепторы, распознаваемые фагом.
2)Проникновение фагового генома через клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану внутрь клетки и освобождение его от оболочки (раздевание фага).
3)Установление фагового генома с помощью белка-лоцмана для реализации содержащейся в геноме информации:
4)Репликация фаговой геномной ДНК или РНК.
5)Сборка вновь синтезированных вирионов — заключение геномной НК в белковую оболочку, морфогенез фагов.
6) Выход вновь синтезированных фагов из клетки:
а) путем отпочковывания;
б) путем лизиса клетки изнутри. Он осуществляется свободным лизоцимом и вызывает гибель клетки.
Практическое применение фагов. Благодаря своему разрушающему (литическому) действию на бактерии фаги могут быть использованы с лечебно-профилактической целью при различных заболеваниях (дизентерия, холера, различные гнойно-воспалительные заболевания и т. д.). Наборы стандартных фагов, в том числе международные, используются для фаготипирования возбудителей ряда болезней (холеры, брюшного тифа, сальмонеллезов, дифтерии, стафилококковых и других заболеваний). Фаги широко используют для изучения генетики микроорганизмов.
5. Бактериофаги. Вирулентные и умеренные фаги. Механизм взаимодействия вирулентного фага с микробной клеткой. Особенности морфогенеза крупных фагов.
Бактериофаги— вирусы бактерий. Бактериофагия — процесс взаимодействия фагов с бактериями, заканчивающийся очень часто их разрушением.
Различают фаги инфекционные, т. е. способные вызвать разные формы фаговой инфекции, и неинфекционные (вегетативные), или незрелые, фаги, находящиеся еще в стадии размножения. В свою очередь инфекционные фаги разделяют на покоящиеся (находящиеся вне клетки), вирулентные — способные вызвать продуктивную форму инфекции, и умеренные фаги — способные вызывать не только продуктивную, но и редуктивную фаговую инфекцию.
Механизм взаимодействия вирулентного фага с микробной клеткой.
1)Адсорбция фагов на клеточной поверхности бактерий при помощи специфических рецепторов (белков-лоцманов), которые располагаются на кончике нити, шипа или хвостика. В свою очередь, на клеточной стенке бактерии располагаются ее фагоспецифические рецепторы, распознаваемые фагом.
2)Проникновение фагового генома через клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану внутрь клетки и освобождение его от оболочки (раздевание фага).
3)Установление фагового генома с помощью белка-лоцмана для реализации содержащейся в геноме информации:
4)Репликация фаговой геномной ДНК или РНК.
5)Сборка вновь синтезированных вирионов — заключение геномной НК в белковую оболочку, морфогенез фагов.
6) Выход вновь синтезированных фагов из клетки:
а) путем отпочковывания;
б) путем лизиса клетки изнутри. Он осуществляется свободным лизоцимом и вызывает гибель клетки.
Особенности морфогенеза фагов.
Морфогенез мелких фагов протекает по типу самосборки. У крупных фагов этот процесс носит более сложный характер. Например, морфогенез фага Т4 требует активности более чем 40 генов и протекает при участии трех самостоятельных линий. На одной из них происходит сборка хвостика (участвует около 20 генов), на другой — головки фага (не менее 16 генов) и на третьей — сборка ворсинок (5 генов). Соединение хвостика с головкой не требует участия генов, однако оно не может произойти до тех пор, пока и хвостик, и головка не будут смонтирова ны полностью. Точно
так же ворсинки могут присоединяться к хвостику только после того, как он соединится с полностью готовой головкой. Благодаря строгому генетическому контролю со стороны фага обеспечивается последовательность и согласованность всех процессов его внутриклеточного размножения.
Выход сформировавшихся фагов в большинстве случаев происходит благодаря лизису изнутри свободным лизоцимом. Он синтезируется на самом последнем этапе размножения фага. Иногда бывает лизис бактерий извне как следствие адсорбции многих фагов на одной клетке, но при этом размножения фагов не происходит.
Обычно же после внедрения фагового генома в клетку у нее возникает состояние иммунитета к суперинфекции данным фагом, т. е. проникновение других фаговых геномов становится невозможным. Иммунитет обеспечивается особым цитоплазматическим репрессором.
6. Методы культивирования вирусов. Заражение животных, куриных эмбрионов. Получение культур клеток. Среды, применяемые для культур клеток. Цитопатический эффект и его проявления. Реакция гемадсорбции.
Для культивирования вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы и чувствительных лабораторных животных. Эти же методы используют и для культивирования риккетсий и хламидий — облигатных внутриклеточных бактерий, которые не растут на искусственных питательных средах.
Культуры клеток. Культуры клеток готовят из тканей животных или человека. Культуры подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые.
Приготовление первичной культуры клеток складывается из нескольких последовательных этапов: измельчения ткани , разъединения клеток путем трипсинизации, отмывания полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост, например в среде 199 с добавлением телячьей сыворотки крови.
Перевиваемые культуры в отличие от первичных адаптированы к условиям, обеспечивающим им постоянное существование in vitro, и сохраняются на протяжении нескольких десятков пассажей.
Перевиваемые однослойные культуры клеток приготовляют из злокачественных и нормальных линий клеток, обладаю - щих способностью длительно размножаться in vitro в определенных условиях. К ним относятся злокачественные клетки HeLa, первоначально выделенные из карциномы шейки матки, Нер-3 (из лимфоидной карциномы), а также нормальные клетки амниона человека, почек обезьяны и др.
К полуперевиваемым культурам относятся диплоидные клетки человека. Они представляют собой клеточную систему, сохраняющую в процессе 50 пассажей (до года) диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток используемой ткани. Диплоидные клетки человека не претерпевают злокачественного перерождения и этим выгодно отличаются от опухолевых.
О размножении (репродукции) вирусов в культуре клеток судят по цитопатическому действию (ЦПД), которое может быть обнаружено микроскопически и характеризуется морфологическими изменениями клеток.
Характер ЦПД вирусов используют как для их обнаружения (индикации), так и для ориентировочной идентификации, т. е. определения их видовой принадлежности.
Один из методов индикации вирусов основан на способности поверхности клеток, в которых они репродуцируются, адсорбировать эритроциты — реакция гемадсорбции. Для ее постановки в культуру клеток, зараженных вирусами, добавляют взвесь эритроцитов и после некоторого времени контакта клетки промывают изотоническим раствором хлорида натрия. На поверхности пораженных вирусами клеток остаются прилипшие эритроциты.
Количество вирусных частиц определяют методом титрования по ЦПД в культуре клеток . Для этого клетки культуры заражают десятикратным разведением вируса. После 6—7-дневной инкубации их просматривают на наличие ЦПД. За титр вируса принимают наибольшее разведение, которое вызывает ЦПД в 50 % зараженных культур. Титр вируса выражают количеством цитопатических доз.
Более точным количественным методом учета отдельных вирусных частиц является метод бляшек.
Некоторые вирусы можно обнаружить и идентифицировать по включениям, которые они образуют в ядре или цитоплазме зараженных клеток.
Куриные эмбрионы. Куриные эмбрионы по сравнению с культурами клеток значительно реже бывают контаминированы вирусами и микоплазмами, а также обладают сравнительно высокой жизнеспособностью и устойчивостью к различным воздействиям.
Для получения чистых культур риккетсий, хламидий. и ряда вирусов в диагностических целях, а также для приготовления разнообразных препаратов (вакцины, диагностикумы) используют 8—12-дневные куриные эмбрионы. О размножении упомянутых микроорганизмов судят по морфологическим изменениям, выявляемым после вскрытия эмбриона на его оболочках.
О репродукции некоторых вирусов, например гриппа, оспы, можно судить по реакции гемагглютинации (РГА) с куриными или другими эритроцитами.
К недостаткам данного метода относятся невозможность обнаружения исследуемого микроорганизма без предварительного вскрытия эмбриона, а также наличие в нем большого количества белков и других соединений, затрудняющих последующую очистку риккетсий или вирусов при изготовлении различных препаратов.
Лабораторные животные. Видовая чувствительность животных к определенному вирусу и их возраст определяют репродуктивную способность вирусов. Во многих случаях только новорожденные животные чувствительны к тому или иному вирусу (например, мыши-сосунки — к вирусам Коксаки).
Преимущество данного метода перед другими состоит в возможности выделения тех вирусов, которые плохо репродуцируются в культуре или эмбрионе. К его недостаткам относятся контаминация организма подопытных животных посторонними вирусами и микоплазмами, а также необходимость последующего заражения культуры клеток для получения чистой линии данного вируса, что удлиняет сроки исследования.
7. Особенности размножения вирусов, геном которых представлен однонитчатой ДНК. Репликативная и промежуточная репликативные формы. Особенности размножения вирусов, геном которых представлен однонитчатой РНК.
Однонитевая ДНК. Ее репликация происходит через образование вначале репликативной формы, а затем промежуточной репликативной формы. Репликативная форма возникает в результате синтеза на исходной вирионной ДНК («+» нити) комплементарной ей «—» нити, т. е. однонитевая ДНК превращается в двунитевую структуру ДНК. Промежуточная репликативная форма — это репликативная форма, «—» нить которой служит матрицей для синтеза «+» нити ДНК, идентичной исходной вирионной ДНК. Такой механизм обеспечивает передачу генов дочерним вирио-
нам (рис. 80.1).
У вирусов, геном которых представлен однонитевой РНК, ее репликация происходит по следующей схеме: вначале на вирионной РНК (вРНК) синтезируются комплементарные ей РНК (кРНК). Этот процесс катализируется специфической РНК-репликазой I. Затем на кРНК синтезируется комплементарная ей, но идентичная исходной вирионная РНК (вРНК ), этот процесс также катализируется специфической репликазой И. Таким образом, репликация идет по схеме:
вРНК > кРНК > вРНК.
Общие закономерности размножения вирусов.
Во-первых, все РНК-содержащие вирусы, кроме вирусов гриппа и ретровирусов, размножаются в цитоплазме. Для своего размножения вирусы гриппа А и В и ретровирусы проникают в ядро, что связано с особенностями поведения их генома. Во-вторых, размножение всех ДНК-содержащих вирусов, кроме вирусов оспы, протекает в ядре, где происходит транскрипция и репликация их геномных нуклеиновых кислот, и в цитоплазме, где происходит трансляция вирусных белков, их процессинг и морфогенез вирионов. Лишь размножение вирусов группы оспы происходит в цитоплазме клетки, поскольку они обладают собственными системами транскрипции.
8. Реакция гемагглютинации, ее механизм у вирусов гриппа. Реакция торможения гемагглютинации, ее практическое применение.
Реакция гемагглютинации (РГ). Применяется для обнаружения вирусов в культуральной жидкости культуры клеток либо хорионаллантоисной или амниотической жидкости куриного эмбриона.
9. Методы микробиологической диагностики вирусных заболеваний. Методы выделения и идентификации вирусов. Серологические реакции, используемые для диагностики вирусных болезней.
ДЛЯ диагностики вирусных заболеваний применяют следующие методы:
1)Вирусоскопический.
2)Иммунной электронной микроскопии.
3)Вирусологический.
4)Серологический.
5)Иммунофлуоресцентный.
6)Биологический.
7)Использование ДНК-(РНК)-зондов.
8)Цепная полимеразная реакция.
О размножении (репродукции) вирусов в культуре клеток судят по цитопатическому действию (ЦПД), которое может быть обнаружено микроскопически и характеризуется морфологическими изменениями клеток.
Характер ЦПД вирусов используют как для их обнаружения (индикации), так и для ориентировочной идентификации, т. е. определения их видовой принадлежности.
Методов индикации вирусов:
1)Реакция гемадсорбции - основан на способности поверхности клеток, в которых они репродуцируются, адсорби - ровать эритроциты — реакция гемадсорбции. Для ее постановки в культуру клеток, зараженных вирусами, добавляют взвесь эритроцитов и после некоторого времени контакта клетки промывают изотоническим раствором хлорида натрия. На поверхности пораженных вирусами клеток остаются прилипшие эритроциты.
2)Реакция гемагглютинации (РГ). Применяется для обнаружения вирусов в культуральной жид кости культуры клеток либо хорионаллантоисной или амниотической жидкости куриного эмбриона.
Серологические методы могут быть использованы для обнаружения в исследуемом материале как специфических антител, так и вирусных антигенов. Для этих целей могут быть использованы все известные серологические реакции:
1)Реакция связывания комплемента.
2)Реакция пассивной гемагглютинации и ее варианты (РНАг, РНАт).
3)Реакция торможения гемагглютинации.
4)Реакция гемагглютинации иммунного прилипания (комплекс антиген + анти тело в присутствии комплемента адсорбируется на эритроцитах).
5)Реакции преципитации в геле.
6)Реакции нейтрализации вирусов.
7)Радиоиммунный метод.
8)Методы иммуноферментного анализа.
Из перечисленных методов все большей популярностью пользуются методы иммуноферментного анализа, отличающиеся высокой специфичностью и удобством использования.
10. Особенности противовирусного иммунитета. Роль фагоцитоза и гуморальных факторов в иммунитете. Интерфероны, характеристика основных свойств, классификация. Особенности действия интерферонов на вирусы.
В защите организма от вирусов участвуют все системы иммунитета, однако противовирусный иммунитет имеет существенные специфические черты. Они определяются тем, что в первую очередь на проникновение вируса в организм реагируют не системы комплемента и макрофагов, а системы интерферонов и Т-киллерных клеток. Другая особенность формирования иммунитета связана с тем, что вирусы оказывают слабое антигенное воздействие на В- лимфоциты и для их активирования, пролиферации и дифференцировки необходимо участие Т-хелперов и соответственно представление последним процессированного вирусного антигена (пептидных фрагментов) при участии молекул МНС класса II. Поэтому роль макрофагов и других антигенпредставляющих клеток заключается не столько в самом фагоцитозе, сколько в процессировании и представлении антигена.
На проникновение вируса раньше всего реагирует система интерферонов, которые подавляют внутриклеточное размножение вирусов. Кроме того, противовирусное действие оказывают находящиеся в сыворотке крови a- и b- ингибиторы. Альфа-ингибитор — термостабильный субстрат, входит в состав а-глобулинов, препятствует адсорбции вирусов на клетке, Разрушается нейраминидазой орто- и парамиксовирусов. Бета-ингибитор — термолабильный мукопептид, входит в состав b-глобулинов, подавляет размножение орто- и парамиксовирусов.
Однако интерферонов и ингибиторов оказалось недостаточно для защиты от вирусов, поэтому природа создала против вирусов другой, очень мощный механизм защиты на уровне организма. Он представлен прежде всего Т- цитотоксическими лимфоцитами и другими киллерными клетками. Эти клетки распознают все чужеродные антигены, в том числе и вирусные, предсталяемые им молекулами МНС класса I. Главное биологическое значение Т-киллерных клеток и заключается в обнаружении и уничтожении любых клеток, инфицированных чужеродными антигенами.
Интерферон представляет собой семейство белков-гликопротеидов, которые синтезируются клетками иммунной системы и соединительной ткани. В зависимости от того, какими клетками синтезируется интерферон, выделяют три типа: α, β и γ-интерфероны.
Альфа-интерферон вырабатывается лейкоцитами и он получил название лейкоцитарного; бета-интерферон называют фибробластным, поскольку он синтезируется фибробластами — клетками соединительной ткани, а гамма-интерферон
— иммунным, так как он вырабатывается активированными Т-лимфоцитами, макрофагами, естественными киллерами , т. е. иммунными клетками.
Выработка интерферона резко возрастает при инфицировании вирусами, помимо противовирусного действия интерферон обладает противоопухолевой защитой, так как задерживает пролиферацию (размножение) опухолевых клеток, а также иммуномодулирующей активностью, стимулируя фагоцитоз, естественные киллеры, регулируя антителообразование В-клетками, активируя экспрессию главного комплекса гистосовместимости.
Механизм действия. Интерферон непосредственно на вирус вне клетки не действует, а связывается со специальными рецепторами клеток и оказывает влияние на процесс репродукции вируса внутри клетки на стадии синтеза белков.
ГНОЕРОДНЫЕ КОККИ
1. Стафилококки. Общая характеристика свойств. Факторы патогенности. Токсины, образуемые стафилококками, генетический контроль их синтеза. Современная классификация стафилококков и ее принципы.
Стафилококки — грамположительные, правильной геометрической формы шаровидные клетки диаметром 0,5—1,5 мкм, располагающиеся обычно в виде гроздьев, каталазопозитивны, восстанавливают нитраты в нитриты, активно гидролизуют белки и жиры, сбраживают в анаэробных условиях глюкозу с образованием кислоты без газа. Обычно могут расти в присутствии 15 %-ного NаС1 и при температуре 45 °С. Не имеют жгутиков, не образуют спор. Стафилококки
— факультативные анаэробы. Стафилококки не требовательны к питательным средам, хорошо растут на обычных средах, температурный оптимум для роста 35—37 °С, рН 6,2-8,4 Колонии круглые, 2—4 мм в диаметре, с ровными краями, выпуклые, непрозрачные, окрашены в цвет образуемого пигмента. Рост в жидкой культуре сопровождается равномерным помутнением, со временем выпадает рыхлый осадок. При росте на обычных средах стафилококки не образуют капсулы, при посеве уколом в полужидкий агар с плазмой или сывороткой большинство штаммов S. aureus образует капсулу.
Факторы патогенности стафилококков. Стафилококки могут поражать любую ткань, любой орган. Это свойство стафилококков обусловлено наличием у них большого комплекса факторов патогенности.
1)Факторы адгезии — прикрепление стафилококков к клеткам тканей обусловлено их гидрофобностью (чем она выше, тем сильнее проявляются адгезивные свойства), а также адгезивными свойствами полисахаридов, возможно также белка А, и способностью связывать фибронектин (рецептор некоторых клеток).
2)Разнообразные ферменты, играющие роль факторов «агрессии и защиты»: плазмокоагулаза (главный фактор патогенности), гиалуронидаза, фибринолизин, ДНКаза, лизоцимоподобный фермент, лецитиназа, фосфатаза, протеиназа и т. д.
3)Комплекс секретируемых экзотоксинов:
а) мембраноповреждающие токсины — а, b, d и у.
б) эксфолиативные токсины А и В различают по антигенным свойствам, отношению к температуре (А — термостабилен, В — термолабилен), локализации генов, контролирующих их синтез (А контролируется хромосомным геном, В — плазмидным). Нередко у одного и того же штамма синтезируются оба эксфолиатина, С этими токсинами связана способность стафилококков вызывать пузырчатку у новорожденных, буллезное импетиго, скарлатиноподобную сыпь;
в) истинный лейкоцидин — токсин, отличающийся от гемолизинов по антигенным свойствам, избирательно действует на лейкоциты, разрушая их;
г) экзотоксин, вызывающий синдром токсического шока (СТШ). Он обладает свойствами суперантигена. Для СТШ характерны повышение температуры, снижение артериального давления, кожные высыпания с последующим шелушением на кистях и стопах, лимфоцитопения, иногда диарея, поражение почек и др.
4)Сильные аллергизирующие свойства. Аллергены способны вызывать реакции ги перчувствительности как замедленного типа (ГЧЗ), так и немедленного типа (ГЧН).
5)Перекрестно реагирующие антигены (с изоантигенами эритроцитов А и В, почек и кожи — индукция аутоантител, развитие аутоиммунных заболеваний).
6)Факторы, угнетающие фагоцитоз. Фагоцитоз угнетают капсула, белок А, пептидогликан, тейхоевые кислоты, ток -
сины.
7)Митогенное действие стафилококков в отношении лимфоцитов (этим действием обладают белок А, энтеротоксины и другие продукты, секретируемые стафилококками).
8)Энтеротоксины А, В, С1, С2, СЗ, D, Е. Они характеризуются антигенной специфичностью, термостабильностью,
устойчивостью к действию формалина (не превращаются в анатоксины) и пищеварительных ферментов (трипсина и пепсина), устойчивы в диапазоне рН от 4,5 до 10,0.
Классификация. Род Staphylococcus включает в себя более 20 видов, которые подразделяются на две группы — коагулазоположительные и коагулазоотрицательные стафилококки. Для дифференциации видов используют различные признаки.
Патогенными для человека являются, главным образом, коагулазоположительные стафилококки, но многие коагулазоотрицательные также способны вызывать заболевания, S. aureus в зависимости от того, кто является его основным носителем, разделяется на 10 эковаров (hominis, bovis, jvis И др.).
Штаммы S. aureus различаются по чувствительности к стафилококковым фагам. Для типирования S. aureus используют международный набор из 23 умеренных фагов, которые разделены на четыре группы.
Отношение стафилококков к фагам своеобразное: один и тот же штамм может лизироват ься либо одним фагом, либо одновременно несколькими. Но поскольку чувствительность их к фагам является признаком относительно стабильным, фаготипирование стафилококков имеет важное эпидемиологическое значение. Недоста ток этого метода состоит в том, что типированию поддается не более 65—70 % S. aureus. В последние годы получены наборы специфических фагов и для типирования S. epidermidis.
2. Микробиологический диагноз стафилококковых заболеваний. Выделение стафилококков, определение их патогенности, чувствительности к антибиотикам и фаготипирование.
Лабораторная диагностика. Основной метод — бактериологический; разработаны и внедрены серологические реакции.
В случае необходимости (при интоксикациях) прибегают к биологической пробе. Материалом для бактериологического исследования служат кровь, гной, слизь из зева, носа, отделяемое ран, мокрота (при стафилококковой пневмонии), испражнения (при стафилококковом колите), в случае пищевых интоксикаций — рвотные массы, испражнения, промывные воды желудка, подозрительные продукты.
Материал засевают на кровяной агар (гемолиз), на молочно-солевой (молочно-желточно-солевой) агар (угнетается рост посторонних бактерий за счет NаСl, лучше выявляются пигмент и лецитиназа). Выделенную культуру идентифицируют по видовым признакам, определяют у нее наличие основных признаков и факторов патогенности (золотистый пигмент, сбраживание маннита, гемолиз, плазмокоагулаза), обязательно проверяют чувствительность к антибиотикам, в случае необходимости проводят фаготипирование. Из числа серологических реакций для диагностики гнойно-септических заболеваний применяют РПГА и ИФМ, в частности для определения антител к тейхоевой кислоте или к видоспецифическим антигенам.
Для определения энтеротоксигенности стафилококков используют три метода:
7. серологический — с помощью специфических антитоксических сывороток в реакции преципитации в геле обнаруживают энтеротоксин и устанавливают его тип; 7. биологический — внутривенное введение фильтрата бульонной культуры стафилококка кошкам в дозе 2—3 мл на 1 кг веса. Токсины вызывают у кошек рвоту и понос;
7. непрямой бактериологический метод — выделение из подозрительного продукта чистой культуры стафилококка и определение у него факторов патогенности (образование энтеротоксина коррелирует с наличием других факторов патогенности, в частности РНК-азы).
Наиболее простым и чувствительным является серологический метод обнаружения энтеротоксина.
3. Стрептококки. Характеристика морфологических, культуральных свойств, антигенное строение. Серологическая классификация. Факторы патогенности стрептококков. Особенности патогенеза стрептококковых болезней. Характеристика свойств пневмококков.
Стрептококки — грамположительные, цитохромнегативные, каталазонегативные клетки шаровидной или овоидной формы диаметром 0,6—1,0 мкм, растут в виде цепочек различной длины или в виде тетракокков; неподвижны. Спор не образуют. Патогенные стрептококки образуют капсулу. Стрептококки — факультативные анаэробы, но имеются и строгие анаэробы. Температурный оптимум 37 °С, оптимальная рН 7,2—7,6. На обычных питательных средах патогенные стрептококки или не растут, или растут очень скудно. Для их культивирования обычно используют сахарный бульон и кровяной агар, содержащий 5 % дефибринированной крови. Среда не должна содержать восстанавливающих cахаров, так как они угнетают гемолиз. На бульоне рост придонно-пристеночный в виде крошковатого осадка, бульон прозрачен. Стрептококки, образующие короткие цепочки, вызывают помутнение бульона. На плотных средах стрептококки серогруппы А образуют колонии трех типов:
а) мукоидные б) шероховатые
в) гладкие - невирулентные культуры.
Классификация стрептококков. Род стрептококков включает около 50 видов. Среди них выделяют 4 патогенных (S. pyogenes, S. pneumoniae, S. agalactiae и S. equi)
Cерологическая классификация. Стрептококки имеют сложное антигенное строение: у них имеется общий для всего рода антиген и различные другие антигены. Среди них особое значение для классификации имеют группоспецифические полисахаридные антигены, локализованные в клеточной стенке. По этим антигенам стрептококки разделены на серологические группы, обозначаемые буквами А, В, С, D, F, С и т. д. Сейчас известны 20 серологических групп стрептококков (от А до V). Патогенные для человека стрептококки относятся к группе А, к группам В и D, реже
— к С, F и G. В связи с этим определение групповой принадлежности стрептококков является решающим моментом в диагностике вызываемых ими болезней.
У гемолитических стрептококков обнаружены типоспецифические антигены. У стрептококков группы А ими являются белки М, Т и R.
R-антиген обнаружен также у стрептококков серогрупп В, С и D. Он чувствителен к пепсину, но не к трипсину, разрушается при нагревании в присутствии кислоты, но устойчив при умеренном нагревании в слабом щелочном растворе.
По М-антигену гемолитические стрептококки серогруппы А подразделяют на большое количество серовариантов (около 100), их определение имеет эпидемиологическое значение.
По Т-белку стрептококки серогруппы А также подразделяют на несколько десятков серовариантов. В группе В различают 8 серовариантов.
Стрептококки имеют перекрестно реагирующие антигены.
Основные факторы патогенности стрептококков.
1)Белок М — главный фактор патогенности. М-белки стрептококка - фибриллярные молекулы, образуют фимбрии на поверхности клеточной стенки стрептококков группы А. М-белок определяет адгезивные свойства, угнетает фагоцитоз, определяет антигенную типоспецифичность и обладает свойствами суперантигена.