Презентация / РыскинаЕА_Лекция по энзимологии
.pdfИЗУЧЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ КЛЕТОЧНОГО МЕТАБОЛИЗМА ПОЗВОЛЯЕТ СУДИТЬ О ФУНКЦИОНАЛЬНОМ СОСТОЯНИИ МНОГИХ ОРГАНОВ И СИСТЕМ ДЛЯ КОТОРЫХ ХАРАКТЕРНЫ ТЕ ИЛИ ИНЫЕ ЭНЗИМЫ
▪Например, при механических желтухах характерным является нарастание
содержания щелочной фосфатазы и γ-глутамилтранспептидазы (γ-ГТП)
без большого увеличения активности аминотрансфераз и альдолазы.
▪Изучение активности ферментов, секретируемых в выводные протоки желез, позволяет судить о функционировании органа, ответственного за секрецию этих ферментов в выводные протоки желчных путей, панкреатических и слюнных протоков (α-амилаза, липаза, трипсин). При повышении внутрипротокового давления активность этих ферментов в плазме возрастает за счет “эффекта уклонения ферментов”, т.е. их поступления из протоков железы в кровь и снижения выведения во внешнюю среду.
▪В ряде случаев определенное диагностическое значение имеет установление взаимоотношений между изменениями активности отдельных ферментов или получение своеобразных ферментных спектров крови.
СОВРЕМЕННАЯ ДИАГНОСТИКА В МЕДИЦИНЕ НЕМЫСЛИМА БЕЗ ВЫСОКОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ЛАБОРАТОРНЫХ АНАЛИЗОВ ТАКИХ КАК ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ
▪Иммуноферментный анализ (сокращённо ИФА, англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) — лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных низкомолекулярных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело.
ЧТОБЫ ПОНЯТЬ, КАК УСТРОЕН ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ, ПОПРОБУЕМ РАЗОБРАТЬСЯ В СУТИ РЕАКЦИИ «АНТИГЕНАНТИТЕЛО»
▪Антиген — это чужеродная для организма молекула, которая может попасть в тело человека вместе с инфекционным агентом.
▪В организме антигены способны вызывать иммунную реакцию, поэтому наше тело синтезирует особые вещества — антитела (иммуноглобулины), способные по принципу «ключ к замку» соединяться с антигенами, связывая их в иммунный комплекс (этот процесс называется реакцией «антигенантитело»).
▪Реакцию «антиген-антитело» можно воспроизвести в лабораторных условиях: использовать уже готовые антитела или антигены, чтобы определить, есть ли в исследуемом образце соответствующее им соединение.
▪Определение комплекса «антиген-антитело» за счет введения в один из
компонентов реакции ферментативной метки (пероксидаза хрена, бета-
галактозидаза или щелочная фосфатаза) с последующей ее детекцией с помощью соответствующего субстрата используется для постановки ИФА. Субстрат расщепляется ферментом и изменяется цвет продукта реакции - интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител.
ПРЕИМУЩЕСТВА ИФА
▪Бесспорные преимущества ИФА — высокая чувствительность и
специфичность метода.
▪Чувствительность — это возможность распознать искомое вещество, даже если его концентрация в образце невысока.
▪Специфичность же подразумевает безошибочность диагностики: если результат положительный, значит, найдены именно те антитело или антиген, которые предполагались, а не какие-то другие.
▪Невозможно охватить полный список показаний к проведению ИФА.
▪Вот наиболее распространенные цели анализа:
▪1. Диагностика острых и хронических инфекционных заболеваний:
вирусного гепатита А, B, C, E; ВИЧ; цитомегаловирусной инфекции; вируса
Эпштейна-Барр; герпеса, токсоплазма; кори; краснухи; сальмонеллеза, микоплазмоза и различных паразитарных заболеваний.
▪2. Оценка показателей иммунитета человека и маркёров некоторых аутоиммунных заболеваний.
▪3. Выявление онкологических маркёров (простатспецифического антигена и др.)
▪Основной биоматериал для проведения ИФА — это сыворотка крови.
КЛАССИФИКАЦИЯ МЕТОДОВ ИФА
▪В настоящее время используют твердофазный (гетерогенный) ИФА. Один из компонентов пары антиген-антитело прочно связывают (иммобилизируют) на твёрдом носителе (полистирольных микропланшетах), что позволяет провести отделение иммунных комплексов от свободных компонентов.
▪Наиболее часто на практике используются три варианта твердофазного иммуноанализа — непрямой иммуноанализ, прямой иммуноанализ и иммуноанализ сэндвич-типа.
МЕТОД НЕПРЯМОГО ИММУНОАНАЛИЗА ХАРАКТЕРИЗУЕТСЯ ОСУЩЕСТВЛЕНИЕМ 3-Х СТАДИЙНОГО ПРОЦЕССА:
▪На первой стадии антиген адсорбируется на микропланшетах.
▪На второй с антигеном взаимодействуют специфичные к нему антитела.
▪На третьей в систему вводят антивидовые (вторичные) антитела, конъюгированные с ферментом, обуславливающим проведение индикаторной ферментативной реакции. Чаще всего используют меченные ферментом антитела кролика против иммуноглобулинов человека.
▪В данной методике в качестве фермента чаще всего используют пероксидазу хрена. Пероксидаза хрена катализирует реакцию окисления субстрата перекисью водорода. В качестве субстратов пероксидазы хрена используется о-фенилендиамин (ОФД) и перекись водорода, которые добавляют.
▪Перед измерением оптической плотности проводят остановку цветной
реакции с помощью 0,5 М H2SO4. Оптическая плотность раствора
окрашенного продукта измеряется при λ=490 нм с использованием планшетного спектрофотометра.
ПРЯМОЙ ИФА
▪Метод является упрощенным вариантом непрямого ИФА, в котором образование комплекса детектируется непосредственно введением в него меченного ферментом антитела. Поскольку добавленная специфическая метка связана с антителами, значит, концентрация окрашенного продукта реакции равна концентрации антител. А концентрация антител равна концентрации антигенов.
▪Но чувствительность анализа ряда антигенов в этом случае может быть ниже, чем в непрямом ИФА, вследствие возможности связывания с одним антителом.
▪В сендвич варианте иммуноанализа используется пара антител, специфичных к пространственно удаленным эпитопам исследуемого антигена.
▪Конкурентный ИФА: искомые антитела и меченые ферментом антитела конкурируют друг с другом за антигены, сорбированные на твердой фазе. Таким образом, величина детектируемого сигнала, получаемого конкурентным ИФА, находится в обратной зависимости от концентрации антигена. Используется для обнаружения или количественного определения растворимых антител. В организме человека антитела находятся в двух физических формах – растворимой (кровь, тканевая жидкость, секреты) и связанной с наружной мембраной В-лимфоцитов (рецепторные иммуноглобулины).
БЛАГОДАРЮ ЗА ВНИМАНИЕ