Презентация / РыскинаЕА_Лекция по энзимологии

КОЛИЧЕСТВО ИЗОФЕРМЕНТОВ ЛДГ МОЖНО ОПРЕДЕЛИТЬ С ПОМОЩЬЮ КИНЕТИЧЕСКИХ, ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИХ, ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ИЛИ ПУТЕМ ХРОМАТОГРАФИИ.

НАИБОЛЕЕ ВЫСОКА ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ ТЕСТА НА ЛДГ-1 В ПЕРВЫЕ 16-20 ЧАСОВ ПОСЛЕ ПРИСТУПА ИНФАРКТА, КОГДА АКТИВНОСТЬ ЛДГ-1 В СЫВОРОТКЕ КРОВИ УЖЕ ПОВЫШЕНА, А ОБЩАЯ АКТИВНОСТЬ ЛДГ ЕЩЕ В НОРМЕ.

ПРИ ИНФАРКТЕ МИОКАРДА ИЗОФЕРМЕНТ ЛДГ-1 ПЕРВЫМ СРЕДИ ИЗОФЕРМЕНТОВ ЛДГ ПОВЫШАЕТСЯ И ПОСЛЕДНИМ ВОЗВРАЩАЕТСЯ К НОРМЕ

ЩЕЛОЧНАЯ ФОСФАТАЗА (ЩФ) - ФЕРМЕНТ ГИДРОЛАЗА (КФ 3.1.3.1), ОТЩЕПЛЯЮЩАЯ ФОСФАТ ОТ МНОГИХ ТИПОВ МОЛЕКУЛ

▪Спектрофотометрический методы определения активности в биологических жидкостях (сыворотка, плазма) различаются по используемому субстрату и состоят в определении отщепившегося в результате ферментативного гидролиза неорганического фосфата или органического остатка.

▪Унифицированный метод - кинетический энзиматический метод.

Принцип метода: Щелочная фосфатаза в сыворотке определяется путем измерения скорости гидролиза эфира фосфорной кислоты: п- нитрофенилфосфата.

▪п-Нитрофенилфосфат -----------> п-нитрофенол + Н3РО4

▪Скорость гидролиза субстрата прямо пропорциональна активности ЩФ в пробе и измеряется спектрофотометрически при длине волны 405 нм.

▪п-Нитрофенол имеет желтый цвет.

▪Линейность метода: до 800 МЕ.

▪Норма: 35-123 МЕ при 37С.

ЩЕЛОЧНАЯ ФОСФАТАЗА (ЩФ) СОДЕРЖИТСЯ ПРАКТИЧЕСКИ ВО ВСЕХ ТКАНЯХ ЧЕЛОВЕКА.

ОНА ОБРАЗУЕТСЯ В КОСТНОЙ ТКАНИ (ОСТЕОБЛАСТАХ), КОСТНОМ МОЗГЕ, КЛЕТКАХ ПЕЧЕНИ, ПОЧЕК, ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ И МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗАХ ПЕЧЕНЬ ВЫВОДИТ ФЕРМЕНТ С ЖЕЛЧЬЮ

▪Повышение показателя имеет место:

▪1) у детей (нормальный рост костей);

▪2) при костных заболеваниях, связанных с увеличением количества остеобластов, - гиперпаратиреозе, рахите, остеомаляции, опухолях костей, при саркоидозе Бека;

▪3) при закупорке желчных протоков (внутри- и внепеченочных) камнем, спайками, опухолью;

▪4) при заболеваниях печени, вызванных лекарствами, такими как хлорпромазин или метилтестостерон);

▪5) при беременности.

▪Снижение показателя имеет место при гипотиреозе и при замедленном росте у детей.

КИСЛАЯ ФОСФАТАЗА – ФОСФОГИДРОЛАЗА МОНОЭФИРОВ ОРТОФОСФОРНОЙ КИСЛОТЫ (К.Ф. 3.1.3.1).

Методы исследования. Для определения активности кислой фосфатазы в сыворотке крови наиболее часто применяют фотоколориметрический.

Кислая фосфатаза расщепляет субстрат п-нитрофенилфосфат с образованием нитрофенола, дающего в щелочной среде жёлтое окрашивание. Интенсивность окраски раствора соответствует активности фермента.

Скорость гидролиза субстрата прямо пропорциональна активности ЩФ в пробе и измеряется спектрофотометрически при длине волны 405 нм.

Нормальные величины. Сыворотка:

ПОКАЗАНИЯ К ИССЛЕДОВАНИЮ - ЗАБОЛЕВАНИЯ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ (ДИАГНОСТИКА И МОНИТОРИНГ ТЕЧЕНИЯ КАРЦИНОМЫ ПРОСТАТЫ, ОПРЕДЕЛЕНИЕ НАЛИЧИЯ МЕТАСТАЗОВ В КОСТНОЙ ТКАНИ)

▪Повышенные значения:

▪рак предстательной железы;

▪простатит;

▪метастатические поражения костей;

▪миеломная болезнь;

▪болезнь Гоше;

▪болезнь Нимана-Пика.

▪разрушение тромбоцитов при тромбоцитопении, тромбоэмболии, гемолитической болезни.

СЫВОРОТОЧНАЯ ХОЛИНЭСТЕРАЗА КФ (3.1.1.8)

▪Различают два типа холинэстераз - так называемую, истинную холинэстеразу (ацетилхолинэстераза, найденная в эритроцитах, нервной и мышечной ткани) и псевдохолинэстеразу (сывороточная холинэстераза).

▪Эти два типа ХЭ различаются прежде всего по субстратной специфичности. Наиболее специфичным субстратом для истинной ХЭ является ацетилхолин, для псевдо-ХЭ - бутирилхолин.

▪Сывороточная холинэстераза секретируется печенью, содержится в сыворотке крови, печени, поджелудочной железе.

▪При поражении печени активность фермента в сыворотке крови понижается, так как нарушается синтез фермента клетками печени. Определение активности ХЭ не имеет большого значения при остром гепатите, но очень ценно для наблюдения за течением болезни и для определения прогноза при хронических заболеваниях печени.

▪Значительное снижение активности ХЭ сыворотки крови отмечается также при гипотиреозе, бронхиальной астме, ожогах, отравлениях.

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ

▪Спектрофотометрическое определение изменения абсорбции света при гидролизе субстратов, например, бензоилхолина с максимумом поглощения 240 нм.

▪Определение ферментативной активности на ФЭКе:

▪а) по количеству расщепленного ацетилхолина хлорида и образованию уксусной кислоты. Пробы (контроль и опыт) колориметрируют на ФЭКе против воды.

▪Находят разность между показателями ФЭКа для опытной и контрольной проб, затем по калибровочному графику определяют количество уксусной кислоты, образовавшейся в опыте.

▪б) по накоплению продуктов гидролиза в растворе –– по взаимодействию тиохолина (продукта гидролиза специфических субстратов бутирилтиохолина и ацетилтиохолина) с 5,5'-дитио-бис-2-нитробензойной кислотой.

▪В норме ХЭ колеблется в широких пределах: 160— 340 МЕ.

ГЛУТАМИЛТРАНСПЕПТИДАЗА (ГТП, ГЛУТАМИЛТРАНСФЕРАЗА, КФ 2.3.2.2.) КАТАЛИЗИРУЕТ РЕАКЦИЮ ПЕРЕНОСА ГЛУТАМИЛЬНОГО ОСТАТКА КАКОГО-ЛИБО ОЛИГОПЕПТИДА НА АКЦЕПТОРНУЮ АМИНОКИСЛОТУ, ДРУГОЙ ПЕПТИД ИЛИ ВОДУ

▪ В качестве унифицированного утвержден метод с субстратом

L-γ-глутамил-п-нитроанилином в глицинглициловом буфере.

▪ Принцип : γ-Глутамилтранспептидаза переносит глутамильный остаток с L-γ-глутамил-п-нитроанилина на дипептидный акцептор, которым является глицилглицин, служащий одновременно и буфером. Концентрацию освобожденного 4-нитроанилина измеряют колориметрически после остановки реакции подкислением.

▪Нормы: Сыворотка - Мужчины - 15-106 Е/л; Женщины - 10-66 Е/л

▪Повышение активности фермента в сыворотке крови наблюдается при внутри- и внепеченочном холестазе (в сочетании с ростом активности

остальных мембраносвязанных ферментов), при других заболеваниях печени (острые гепатиты, цирроз, опухоли и метастазы в печень), при острых и хронических панкреатитах.

▪ При механических желтухах отмечено возрастание активности в 5-130 раз, при острых панкреатитах — в 25 раз.

СПЕЦИФИЧНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ПАТОЛОГИИ