Презентация / РыскинаЕА_Лекция по энзимологии

ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ ОБУСЛОВЛЕНО РЯДОМ ПРИЧИН:

▪1. Повышение активности может быть результатом ускорения процессов синтеза (щелочная фосфатаза при рахите, гепатите), некроза клеток, понижения выведения, повышении проницаемости клеточных мембран при паталогии.

▪2. Снижение активности вызывается уменьшением числа клеток, секретирующих фермент (холинэстераза при циррозе печени), недостаточностью синтеза, увеличением выведения фермента.

▪3. Степень изменения активности исследуемых ферментов зависит от массы пораженного органа, распределения ферментов между тканями, локализации ферментов во внутриклеточных органеллах.

▪4. При воспалительных процессах в первую очередь выходят цитоплазматические ферменты, при прогрессировании заболевания наблюдается некроз клеток, происходит разрушение органелл и выходят митохондриальные ферменты.

ПРИ ПОСТАНОВКЕ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ РЕАКЦИИ НЕОБХОДИМО ВЫПОЛНЯТЬ СЛЕДУЮЩИЕ УСЛОВИЯ:

▪Для того, чтобы скорость реакции зависела только от концентрации фермента, необходимо определять активность фермента в самом начале реакции в условиях достаточного насыщения его субстратом (субстрат должен быть в избытке).

▪При этом концентрация продуктов реакции недостаточна для того, чтобы началась обратная реакция, отсутствуют разрушение фермента в ходе процесса и возможное ингибирование фермента продуктами реакции.

▪Выдерживать оптимальную температуру (или температуру, указанную в методике) и pH среды, точную концентрацию и вид буфера.

ЕДИНИЦЫ ИЗМЕРЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ

▪Международная единица активности (МE) — это количество фермента, которое катализирует превращение

1мкмоля субстрата в 1 минуту в оптимальных условиях.

▪Катал - единица активности в системе СИ. Соответствует количеству фермента, которое катализирует превращение

1моля субстрата в 1 секунду в оптимальных условиях.

▪Удельная единиц ферментативной активности на 1 мг белка.

▪Молекулярная активность - число молекул субстрата, подвергающихся превращению одной молекулой фермента в минуту.

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЕ И ФОТОКОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА — НАИБОЛЕЕ ШИРОКО ИСПОЛЬЗУЮТСЯ В НАСТОЯЩЕЕ ВРЕМЯ

▪Спектральный анализ основан на свойстве веществ избирательно поглощать падающее на них излучение. При этом устанавливается связь между величиной поглощения и концентрацией вещества в растворе.

▪Фотоколориметрический метод использует в качестве источника «белый свет» и служит для анализа окрашенных растворов.

▪Спектрофотометрический метод анализа использует монохроматичный свет, который может быть получен из разных источников – ртутная лампа, лампа накаливания, спектральный прибор, который выделяет ту или иную длину волны. Более точный метод, т.к., позволяет более строго соблюдать законы поглощения.

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЕ И ФОТОКОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА РАЗЛИЧАЮТСЯ ПО СПОСОБУ ИЗМЕРЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ:

▪1. Непрерывное кинетическое измерение — прямое непрерывное измерение скорости ферментативной реакции в начальной линейной части кривой при оптимизированной концентрации реактивов и условий определения.

▪Способ широко используется в автоматических анализаторах. Наиболее точными и приемлемыми являются спектрофотометрические методы, основанные на оптическом тесте Варбурга и использующие различную величину поглощения при 340 нм окисленной (поглощение отсутствует) и восстановленной (максимальная абсорбция) форм НАД.

▪Прямой оптический тест применяется для определения НАД зависимых дегидрогеназ (лактатдегидрогеназы, сорбитдегидрогеназы).

▪Непрямой оптический тест требует введения дополнительных сопряженных дегидрогеназных реакций (аминотрансферазы). Образующиеся продукты посредством дополнительных ферментативных реакций приводят к окислению НАДH или восстановлению НАД.

▪Спектры поглощении НАД+ (1) и НАДН(Н+) (2)

▪2. Двухточечное измерение — активность фермента определяется по измерению величины накопления продукта (или убыли субстрата) за определенный промежуток времени на начальном этапе реакции.

▪В биохимии для измерений, в которых регистрируется 2 точки и более 2 точек, принят термин “кинетическое” измерение.

▪PS! Непрерывное (многоточечное) измерение оптической плотности в ходе реакции позволяет оценивать характер кинетики и выбирать для расчетов линейный участок кривой.

▪3. Измерение по конечной точке (метод постоянного времени) — измеряется концентрация продукта после остановки реакции в определенный момент времени с помощью ингибитора либо физической инактивации фермента. Поглощение измеряется после окончания реакции при стабильном значении сигнала.

ФЕРМЕНТАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ РАССЧИТЫВАЮТ ПО КАЛИБРАТОРУ, КАЛИБРОВОЧНОЙ КРИВОЙ ИЛИ ПО КОЭФФИЦИЕНТУ ЭКСТИНКЦИИ ПРОДУКТА ИЛИ КОФЕРМЕНТА

▪1. Расчет по калибратору (стандарту) проводят, если можно приготовить стабильный калибратор и включить его в состав набора. Как правило, им является раствор продукта реакции известной концентрации. При этом на всей области определения активности фермента оптическая плотность реакционной смеси должна линейно зависеть от концентрации продукта (субстрата), т. е. подчиняться закону Бугера-Ламберта-Бера. Расчет по калибратору используют, например, при определении активности a-амилазы, глюкозы

▪2. Расчет по калибровочной кривой проводят, если оптическая плотность реакционной смеси нелинейно зависит от концентрации продукта реакции (АСТ, АЛТ)

▪3. Расчет по коэффициенту экстинкции продукта или кофермента

проводят если:

▪эти вещества обладают оптической плотностью и их прямое фотометрирование можно осуществить в процессе анализа

▪оптическая плотность реакционной смеси линейно зависит от концентрации продукта или кофермента (ЛДГ)