Презентация / ЛукашеваЕВ_лек_ферменты_мед_сайт(очистка)
.pdf
Ультрафильтрация
Использование мембран с фиксированным размером пор позволяет делить молекулы по их размерам.
|
Рабочи |
|
|
Название |
й |
Разделение |
|
объем, |
кДа |
||
|
|||
|
мл |
|
|
|
|
|
|
VIVACELL |
10-70 |
5, 10, 30, 50, |
|
70 |
100 |
||
|
|||
|
|
|
5, 10, 30, 50, VIVACELL 20-100 100, 300,
100
1000
VIVACELL |
50-250 |
5, 10, 30, 50, |
|
250 |
100 |
||
|
Хроматографические методы
(от греческих слов χρώμα:chroma, цвет и
γραφειν:grafein, писать)
В основе хроматографии лежит процесс распределения разделяемых компонентов между двумя несмешивающимися фазами.
Пробу вводят в подвижную фазу, которая движется относительно неподвижной фазы, находящейся в колонке или на плоскости. Различия в силе взаимодействия компонентов пробы с неподвижной фазой приводят к тому, что при достаточно большом времени движения компоненты разделяются.
Изобретатель хроматографии русский ученый Михаил Семенович Цвет
(1872—1919)
Исследовал пигменты листьев растений, получил в чистом виде хлорофиллы. Умер от голода в Воронеже.
Различные виды хроматографии основаны на различной природе взаимодействия компонентов пробы с неподвижной фазой:
1. Гидрофобная
2. Ионообменная
3.Адсорбционная
4. Аффинная, основанная на специфическом взаимодействии в-ва и тв. фазы (например, антитело-антиген)
Ионообменная хроматография
Хроматографическую колонку заполняют заряженным носителем. Белки с противоположным зарядом связываются, а остальные вымываются.
CH -COO- + |
|
+ |
||
|
2 |
|
|
|
CH2-COO- |
|
+ |
||
|
|
+ |
|
|
CM целлюлозный |
|
|
|
|
катионообменник |
- |
|
|
|
|
- |
|
|
|
Связавшиеся белки вымывают, |
|
- - |
|
|
|
- |
|
|
|
используя растворы с |
|
- |
||
|
|
|||
повышающимися |
|
|
||
|
|
- |
|
|
концентрациями солей, которые |
|
- |
|
|
экранируют взаимодействие белков с носителем.
Положительно заряженный белок связывается
Отрицательно заряженные белки вымываются
Аффинная хроматография
основанная на специфическом взаимодействии в-ва и твердой фазы (например, антитело-антиген)
Инертный
носитель
Смесь белков
Инертный
носитель
Белки в растворе Очищенный целевой белок
Иммуноаффинная хроматография
•Моноклональные антитела (АТ) связывают с носителем колонки.
•Далее носитель связывает исключительно молекулы антигена по отношению к которому были получены АТ.
•Достоинства метода
-10000-кратная очистка за одну стадию!!!
•Недостатки
-Моноклональные тела дороги.
-Трудно заставить молекулы-антигены отсоединиться от колонки (жесткие условия вымывания белка).
Гель-фильтрация (молекулярное сито) – разделение по размерам - основан на проникновении мелких молекул в поры
Хроматографическая
колонка заполнена пористыми гелеобразными частицами.
Коммерчески доступны носители с различным размером пор.
Мелкие молекулы проникают в поры частиц носителя и «блуждают» в них.
Крупные молекулы проходят мимо частиц.
Вещества вымываются с колонки в порядке убывания М.М.
Метод может быть использован для определения М.М. в-ва с использованием зависимости времени вымывания
стандартных белков от их М.М.
Электорфорез
Разделение белков в электрическом поле по их зарядам.
Электрофорез крови
Количество выделяемых фракций определяется условиями проведения электрофореза.
При электрофорезе
на бумаге и пленках ацетата целлюлозы в клинико-
диагностических лабораториях выделяют 5 фракций (альбумины, α1-, α2-, β- и γ-глобулины),.
В полиакриламидном геле – до 20 и
более фракций.
При использовании более совершенных методов
(радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и других) в составе глобулиновых фракций
выявляются многочисленные индивидуальные белки.